傅國志，郭文陽，馬宗虎，劉蔚，李博凱，孫子滟，王禎欣，李葉青

（1 中國華電科工集團有限公司，北京100160；2 河南省科學(xué)院生物研究所有限責(zé)任公司，河南鄭州450008；3 中國石油大學(xué)（北京）新能源與材料學(xué)院，生物燃氣高值利用北京市重點實驗室，北京102249）

我國作為農(nóng)業(yè)大國，每年都有大量的農(nóng)作物秸稈產(chǎn)出，秸稈是農(nóng)業(yè)生物質(zhì)資源的重要組成部分[1]，但秸稈的處理一直是關(guān)系到國計民生的問題。因為秸稈主要成分是木質(zhì)素、纖維素之類的物質(zhì)，這類物質(zhì)在農(nóng)田或其他自然環(huán)境中難以被降解，保留時間較長，占用土地空間并且影響農(nóng)作物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。隨著我國農(nóng)業(yè)耕種技術(shù)的發(fā)展和作物產(chǎn)量的提升，2013 年我國農(nóng)作物秸稈可收集量達到8.3 億噸，2015 年達到9.0 億噸[2]。近年來，國家對環(huán)保問題和生物質(zhì)能源的重視程度提高，秸稈已經(jīng)成為制備生物沼氣的重要原料。但是隨著秸稈沼氣產(chǎn)業(yè)的不斷深入，很多問題便開始突顯出來。比如單一秸稈厭氧消化產(chǎn)氣率低、進出料困難、運行的穩(wěn)定性較差，這些問題導(dǎo)致投資多，效益低，嚴重制約秸稈沼氣產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[3-4]。

與此同時，伴隨著人們生活水平的提高，對肉制品的需求日漸增加。畜禽養(yǎng)殖行業(yè)發(fā)展迅速，特別是規(guī)?；B(yǎng)殖場的比例持續(xù)升高，其產(chǎn)生的大量畜禽糞便也亟待有效地解決。利用厭氧消化技術(shù)，畜禽糞便可直接作為原料進行消化產(chǎn)沼氣，消化效果優(yōu)于秸稈的厭氧消化。單一原料的厭氧消化已經(jīng)形成了成熟的技術(shù)，并且用在了現(xiàn)實的生活中[5]。但畜禽糞便中氮、磷含量較高，在消化后期氨氮含量肯定會大幅度上升，進而會對厭氧消化產(chǎn)甲烷過程產(chǎn)生抑制作用[6]。因此需要添加一種或多種其他有機物料與糞便混合，通過調(diào)節(jié)物料的配比，使原料的C/N處于合適的范圍內(nèi)，減少實驗過程中大量的氨態(tài)氮釋放和揮發(fā)性脂肪酸（volatile fatty acids,VFA）積累，提高厭氧消化的效率[7-8]。

目前有很多關(guān)于畜禽糞便與秸稈混合發(fā)酵的實驗研究，證明了混合厭氧發(fā)酵可以提高沼氣的產(chǎn)氣率[9-12]。但是靜置的厭氧干發(fā)酵過程，實驗的啟動期長，運行緩慢，產(chǎn)甲烷效率很低。因此，行業(yè)內(nèi)的研究人員開始嘗試改變干發(fā)酵運行狀態(tài)，以提高產(chǎn)甲烷效率。研究表明，通過機械攪拌有助于豬糞和稻草的混合發(fā)酵原料與厭氧微生物之間有效接觸，提高傳質(zhì)效果，從而改善厭氧干發(fā)酵的效率[13]。反應(yīng)過程中，增加滲濾液回流，能使得雞糞和秸稈混合發(fā)酵產(chǎn)甲烷量提高1倍以上[14]，并且回流噴淋的過程能調(diào)整發(fā)酵原料的含水率，增加原料中微生物的數(shù)量，加快原料分解和VFA 的產(chǎn)生[15]。相比于不回流的實驗組，滲濾液回流能使發(fā)酵原料的總固體產(chǎn)氣量提高29.17%[16]。綜上所述，增設(shè)滲濾液回流裝置可以提高干式厭氧發(fā)酵的產(chǎn)氣效率。但前人研究的滲濾液噴淋回流多是集中在固定比例的混合原料進行實驗，并且是全程持續(xù)性噴淋，對于大型的沼氣發(fā)酵工程，消耗能量成本太高，并且原料的最佳配比不夠明確。因此，本實驗選用間歇性滲濾液噴淋裝置，3種不同比例的混合原料（秸稈、豬糞）進行實驗，旨在更加節(jié)能高效的前提下，探索得到使厭氧干發(fā)酵更加高效的混合原料配比，為沼氣產(chǎn)業(yè)化的推廣應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

由于秸稈的總固體含量（total solid, TS）在90%以上，豬糞的TS 也在30%以上，兩者的固含率都比較高，比較適合高固厭氧消化。因此本實驗選擇高固厭氧消化反應(yīng)器（high-solid anaerobic digestion,HS-AD）。HS-AD是處理木質(zhì)纖維素類原料和其他高固含率有機原料的有效方式[17-18]。研究發(fā)現(xiàn)，針對HS-AD 反應(yīng)器原料流動性差、反應(yīng)速率慢的問題，增加滲濾液回流裝置可以有效地提高產(chǎn)氣性能和穩(wěn)定性[19]。相比于液相厭氧消化（liquid anaerobic digestion, L-AD），HS-AD 反應(yīng)器的負荷大，節(jié)約用水量，產(chǎn)生的沼液量少，并且產(chǎn)甲烷性能依然較好[20]。

采用增設(shè)滲濾液回流的HS-AD裝置，秸稈與豬糞混合進料的方法，設(shè)定3種（秸稈∶豬糞）混合比例，分別為R1（1∶1）、R2（2∶1）、R3（1∶2），進行干式厭氧消化實驗。有研究表明，對于回流式HS-AD，設(shè)定前兩周噴淋量是接種液的2 倍左右，第3周是1倍，最后不噴淋的條件，最終產(chǎn)氣效果較好[21]。因此，考慮到節(jié)能增效的初衷，根據(jù)實驗室實際的回流式高固厭氧消化反應(yīng)裝置，設(shè)定噴淋時間，即前兩周4min/6h，第3周2min/6h，之后不噴淋。通過對比實驗過程中液相性質(zhì)的變化、微生物（細菌和古菌）群落的改變以及產(chǎn)甲烷的差異，分析原料配比對厭氧消化的影響，最終得到高固厭氧消化效果較好的混合原料配比。

1 實驗材料和方法

1.1 實驗裝置

實驗采用3個有機玻璃制成的車庫式反應(yīng)器作為反應(yīng)器，有機玻璃厚10mm，反應(yīng)器內(nèi)徑長400mm，寬300mm，高400mm，設(shè)計體積為48L，接種液罐為圓桶形，直徑250mm，高200mm，設(shè)計體積10L。反應(yīng)器和接種液罐由水浴保溫，水浴層厚度為20mm，將水溫控制在(37±0.5)℃，用熱電偶檢測各反應(yīng)器和接種液罐的溫度。接種液由循環(huán)泵吸入反應(yīng)器噴淋回流，噴淋口對稱分布于反應(yīng)器頂部兩處，采用定時系統(tǒng)進行接種液噴淋，可根據(jù)需求調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)子流量計控制噴淋量。厭氧反應(yīng)器底部為一層高50mm 的方形不銹鋼容器，再鋪一層厚10mm、長寬為20～30mm 的小木塊，以分離接種液和消化底物。如圖1所示。

圖1 車庫式厭氧消化系統(tǒng)

1.2 原料和接種物

秸稈來自于河北石家莊，包括水稻秸稈和蘆葦秸稈。豬糞來自河北石家莊某大型養(yǎng)殖場。實驗所用的接種物是取自阿蘇衛(wèi)垃圾場（北京市昌平區(qū)）的垃圾滲濾液（又稱沼液）。在5L玻璃瓶中倒入4L沼液，加入2g 葡萄糖（即0.5g/L），在恒溫培養(yǎng)箱中37℃馴化3周，得到實驗用的接種物。這幾種物質(zhì)的基本特性見表1。

1.3 實驗設(shè)計

設(shè)定消化原料的總質(zhì)量為1600g，將秸稈和豬糞按照質(zhì)量比為1∶1、2∶1、1∶2 的比例稱量，然后混合均勻，對應(yīng)的反應(yīng)器依次設(shè)為R1、R2、R3。各反應(yīng)器中混合原料的性質(zhì)如表2所示。接種液的量按1∶4（質(zhì)量比）添加，即需要接種液6400mL。實驗啟動之前先將混合好的原料放入接種液中浸泡2h，使微生物與原料充分接觸。之后，一并放入車庫式厭氧消化反應(yīng)器中，檢測氣密性，通5min N2保持厭氧環(huán)境，啟動恒溫循環(huán)水，接好集氣袋，開始實驗。其中，循環(huán)泵的噴淋流量為0.8L/min，實驗啟動之后的噴淋條件設(shè)定為：消化前兩周，每隔6h 噴淋1 次，每次噴淋4min；第3周，每隔6h噴淋1次，每次噴淋2min；第4周，不噴淋。

表1 秸稈、豬糞和接種物的基本特性

表2 各反應(yīng)器中混合原料的性質(zhì)

1.4 樣品測試和分析方法

TS 和VS 的測定是利用烘箱、馬弗爐和天平，采用烘干及灼燒恒定法得到；采用實驗室EA3000的元素分析儀（利曼中國，意大利）對秸稈、豬糞和接種物做元素分析；消化后樣品中的單酸含量以及堿度（TIC）用配備有火焰離子化檢測器和DBFFAP 柱的GC 色譜儀分析（安捷倫科技有限公司，美國）；產(chǎn)氣量用濕式防腐氣體流量計（長春汽車濾清器有限責(zé)任公司，中國）測定，氣體的成分用GC9790Ⅱ型熱導(dǎo)氣相色譜儀（浙江福立分析儀器股份有限公司，中國）測得，每次取3 個樣測定，取平均值。

沼液pH用賽多利斯pH計測得；微生物群落的具體方法是先使用DNA 提取試劑盒提取樣品中的總DNA，通過ND-2000 分光光度計（Thermo Fisher Scientific，美國）測定DNA的數(shù)量和質(zhì)量[22]。然后，細菌以16S rRNA基因的V3～V4可變區(qū)序列為靶標，以帶有barcode 序列的338F-806R 為引物[23]，同時古菌使用Arch344F-Arch915R 為引物進行PCR 擴增，得到PCR 產(chǎn)物。最終，PCR 產(chǎn)物經(jīng)過定量及文庫構(gòu)建后，利用Illumina MiSeq PE300平臺（Illumina公司，美國）進行高通量測序。

2 結(jié)果與討論

2.1 甲烷含量

本實驗以秸稈和豬糞作為原料，研究不同配比的秸稈和豬糞對厭氧消化的影響。實驗進行了51天，期間各反應(yīng)器產(chǎn)生的沼氣中甲烷含量變化情況如圖2所示。從實驗啟動的第3天開始取樣，根據(jù)產(chǎn)氣情況，每2～3 天檢測一次甲烷含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實驗開始之后，各反應(yīng)器產(chǎn)生的沼氣中甲烷含量都在不斷上升，達到最大值之后逐漸趨于平穩(wěn)。具體表現(xiàn)為：R1 反應(yīng)器產(chǎn)生的沼氣中甲烷含量從初始的14.7%逐漸增加到63.9%（第18 天），之后穩(wěn)定在60.5%左右；R2從14.9%逐漸增加到66.2%（第25 天），之后穩(wěn)定在60.7%左右；R3 從19.5%逐漸增加到64.2%（第25 天），最終穩(wěn)定在61.3%左右。3組反應(yīng)器產(chǎn)生的沼氣中甲烷含量的大小以及變化趨勢整體很相似，這說明秸稈和豬糞的不同配比對產(chǎn)生的沼氣中甲烷含量的影響較小。

并且從圖1中可以看出，產(chǎn)生的沼氣中甲烷含量達到最大值之前，R3 反應(yīng)器中產(chǎn)生的沼氣甲烷含量均高于R1 和R2 反應(yīng)器。由于R3 反應(yīng)器添加的原始物料中豬糞量是秸稈量的2倍，很明顯豬糞中的可溶性有機物相比于秸稈的可溶性有機物更容易轉(zhuǎn)化為VFA，產(chǎn)甲烷的進程相對較快，這也導(dǎo)致了在實驗進行的前期（前18 天），R3 反應(yīng)器中生成沼氣中的甲烷含量略高于其他兩組反應(yīng)。

2.2 累計甲烷產(chǎn)量和產(chǎn)甲烷速率

一般的厭氧消化反應(yīng)器，接種比（原料與接種液的VS比）在大于4.0的情況下，實驗的啟動期都比較長，在20～30天，運行緩慢[24-25]。如果提高實驗的接種比，整個厭氧反應(yīng)的啟動時間也會隨之增加[26]。本實驗R1、R2和R3反應(yīng)器的接種比分別為7.78、8.99和6.58，均大于4.0，屬于高含固厭氧消化體系，但是從圖3 和圖4 的實驗結(jié)果中可以看出，3 組實驗的啟動期均大約為5 天，明顯比傳統(tǒng)的厭氧消化系統(tǒng)縮短了啟動時間。說明反應(yīng)器中增設(shè)的噴淋體系在一定程度上確實有助于加快反應(yīng)的進行，提高了高含固厭氧消化的效率。隨著實驗的進行，沼氣產(chǎn)量逐漸增加，根據(jù)沼氣中甲烷的含量，換算得到產(chǎn)生的甲烷產(chǎn)量。經(jīng)過51 天的厭氧消化之后，R1 累計產(chǎn)沼氣82.51L，即單位VS產(chǎn)甲烷量為53.8mL/gVS。R2 累計產(chǎn)沼氣229.66L，即單位VS 產(chǎn)甲烷量為131.8mL/gVS；同理得到R3單位VS 產(chǎn)甲烷量為122.9mL/gVS（如圖3 所示）。另外，R2 和R3 實驗組的產(chǎn)甲烷情況與宋香育等[27]的研究結(jié)果相一致，說明產(chǎn)氣結(jié)果具有可靠性。R2 和R3 的累計產(chǎn)甲烷量高于R1 的產(chǎn)甲烷值。同時，對比甲烷的產(chǎn)生速率（如圖4 所示），R1的最大產(chǎn)甲烷速率為3.4mL/(gVS·d)，R2和R3的最大產(chǎn)甲烷速率分別為6.8mL/(gVS·d)和8.3mL/(gVS·d)。因此無論是產(chǎn)甲烷量還是產(chǎn)甲烷速率，R2和R3的值都遠高于R1。分析原因，可能是由于R1反應(yīng)器的物料反應(yīng)過程中微生物群落分布不均導(dǎo)致木質(zhì)素、纖維素類物質(zhì)的降解程度不同；或者是在實驗啟動之后有輕微漏氣現(xiàn)象導(dǎo)致的。

圖3 累計甲烷產(chǎn)量

圖4 甲烷產(chǎn)生速率

2.3 液相性質(zhì)的變化

為了更好地分析實驗前期產(chǎn)氣的差異，這里僅選取了實驗啟動后前28 天的液相樣品，檢測這段時間液相性質(zhì)的變化以及后續(xù)的微生物群落豐富度和多樣性。

2.3.1 揮發(fā)性脂肪酸（VFA）和pH

實驗啟動初期，原料中的易降解物質(zhì)，比如纖維素、蛋白質(zhì)、脂肪等，在微生物的作用下優(yōu)先被分解為小分子酸，同時過程中伴有部分CO2和少量H2產(chǎn)生[28]。隨著這些大分子有機物被體系中的微生物逐步降解，液相中的VFA濃度開始上升（如圖5所示）。厭氧消化反應(yīng)經(jīng)歷過水解、酸化過程（主要在10天以前），緊接著主要就是產(chǎn)甲烷階段。在產(chǎn)甲烷的過程中，互營微生物之間或者是微生物與外界物質(zhì)之間存在有電子轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象[29-30]。液相中的VFA，比如甲酸、乙酸等，在互營菌和產(chǎn)甲烷菌的作用下，甲酸可作為電子轉(zhuǎn)移的載體，乙酸作為電子供體，轉(zhuǎn)化為甲烷。從圖5中可以看出，在第12 天，R1 和R2 液相中VFA 含量較高，分別為7129.5mg/L 和7945.3mg/L；在 第9 天，R3 液相 中VFA 含量為4042mg/L，遠低于R1 和R2 中VFA 的含量。分析原因是由于R3（1∶2）混合原料中豬糞質(zhì)量為秸稈的2 倍，整體總VS 的含量較少，導(dǎo)致水解后原料中最大VFA 含量并不高。在第10 天左右，3組實驗的VFA含量都達到最高水平，液相對應(yīng)的pH處于最低的狀態(tài)，在7.0～7.7之間，如圖6 所示。相比于其他兩組，R2 的pH 是最小值7.0，推測是因為R2 實驗組中秸稈含量較多，能跟酸反應(yīng)的堿性物質(zhì)相對較少。在第13 天之后，隨著VFA 中的很大一部分單酸被產(chǎn)甲烷菌利用開始轉(zhuǎn)化為甲烷，甲烷的產(chǎn)生速率達到最大，加上系統(tǒng)內(nèi)部的自我調(diào)節(jié)，相應(yīng)的液相pH 也開始緩慢上升最終至相對穩(wěn)定的范圍。第28天各組pH維持在8.3，實驗結(jié)束后（第51天，圖中未顯示）測得3組沼液pH均在7.5左右。同樣的，由于R3中豬糞含量多，體系偏堿性，pH始終在7.5以上。

由圖5和圖6可知，混合原料中VS含量越大的實驗組（R1、R2），其在厭氧消化過程中的VFA濃度越高，但由于3組反應(yīng)器中產(chǎn)甲烷的過程都是相同的，所以VFA 濃度的整體變化趨勢是相同的。另外VS 含量較低的實驗組（R3），在厭氧消化過程中pH的變化比較平緩。反應(yīng)體系中的VFA與pH互相驗證，能在一定程度上反映產(chǎn)甲烷能力。

圖5 液相中VFA的變化

圖6 液相中pH的變化

2.3.2 碳氮比和堿度

實驗原料的碳氮比對于厭氧消化體系中的氨氮濃度和VFA 含量的變化起著至關(guān)重要的作用。有多種研究表明，碳氮比處于15～18的范圍內(nèi)時，整個厭氧實驗進行地比較平穩(wěn)，這與初始原料的性質(zhì)和厭氧消化微生物的生長環(huán)境密切相關(guān)[31-32]。如果反應(yīng)器中的碳氮比不合適，會造成反應(yīng)過程中VFA 或者是氨氮濃度的大量增加，影響厭氧微生物，特別是產(chǎn)甲烷菌群的活性，嚴重時會導(dǎo)致實驗以失敗而告終[33]。本研究是中溫下進行的實驗，混合原料的碳氮比處于15～16之間，處于反應(yīng)體系穩(wěn)定運行的合適范圍，能使厭氧微生物進行正常的生長代謝，很大程度上確保了系統(tǒng)的穩(wěn)定性。

在厭氧消化的過程中，總堿度（total inorganic carbon,TIC）是衡量反應(yīng)體系緩沖能力強弱的重要指標，是檢測反應(yīng)器能否平穩(wěn)運行的重要參數(shù)，并且還可以估計液相中VFA濃度[34]。反應(yīng)過程中主要依靠堿度中和酸性物質(zhì)，維持pH 的穩(wěn)定性，保持消化微生物的活性。如圖7所示，從實驗開始到第13 天，3 組實驗TIC 的濃度均持續(xù)下降。在這個階段VFA的濃度在不斷增加，液相中的TIC因中和一部分VFA 被消耗，導(dǎo)致濃度大幅度降低。由于R2在實驗過程中產(chǎn)生的VFA含量最高，對應(yīng)的TIC濃度自然就最低，為3757.9mg/L。之后，隨著產(chǎn)甲烷階段VFA的消耗，TIC的濃度開始逐漸升高。在第28天，相比較R1和R2而言，R3的TIC濃度是最低的，僅比初始值提升了16.2%。與VFA濃度的變化趨勢相反，VS 含量較低的實驗組（R3），液相中TIC的變化幅度較小，趨勢相對平緩，表明實驗體系的緩沖能力相對較弱。R2 實驗組液相中TIC 的變化幅度很大，造成這種結(jié)果的原因很可能是原始混合物料中VS含量的不同。

圖7 液相中TIC的變化

2.4 微生物群落分析

厭氧消化實驗啟動之后，對3個反應(yīng)器每周取一次沼液（循環(huán)的接種液），總計取4次，加上1份實驗開始前的接種液，共13 份樣品進行微生物分析。

2.4.1 細菌

從圖8～10 中可以看出，隨著反應(yīng)的進行，在R1反應(yīng)器中，梭菌科（Clostridiaceae）在實驗啟動前期大幅度降低（由23.53%降到最低8.21%），而后緩慢增加；紫單胞菌科（Porphyromonadaceae）在實驗啟動之后增加很明顯（由1.46%增加到最大22.4%），R2與R3反應(yīng)器中此菌的變化情況均與此類似。假單胞菌科（Pseudomonadaceae）屬于革蘭氏陰性菌，表面極易生菌毛，能運動，多數(shù)具有分解蛋白質(zhì)和脂肪的能力，是一種能廣泛地利用有機化合物作為碳源和產(chǎn)生能量的電子供體。此菌科含量在實驗開始后有部分增加，而后又逐漸降低。對比R2、R3反應(yīng)器，可以發(fā)現(xiàn)假單胞菌在實驗開始初期增加較大，隨著實驗的進行，后期含量較小。推測原因是R2 中的秸稈含量是豬糞的2 倍，秸稈中的纖維素類物質(zhì)屬于易降解成分，優(yōu)先被微生物降解成小分子物質(zhì)，之后轉(zhuǎn)化為甲烷，剩余木質(zhì)素成分難以被微生物降解利用[35]，小分子物質(zhì)含量愈發(fā)減少，導(dǎo)致相對應(yīng)的假單胞菌科含量開始下降；推測R3 中本身豬糞含量相對較多，也即初始階段易降解成分較多，原料的利用率相對較高，所以產(chǎn)氣量較大，然后在厭氧消化的后期，原料中易降解的成分剩余較少，可被利用的有機化合物含量不足，不利于假單胞菌的生長。另外，從圖7 可知，細菌Caldicoprobacteraceae的含量變化特別明顯（由0.9%增加到最大8.03%），它是一種嗜熱蛋白質(zhì)水解菌[36]，這可能與反應(yīng)體系一直保持在37℃有很大關(guān)系， 畢竟這樣的中溫環(huán)境有利于Caldicoprobacteraceae菌科的生長。從圖9和圖10中可以看出，R2和R3反應(yīng)器的檢測結(jié)果顯示，此菌變化趨勢與R1反應(yīng)器中基本一致。特別是在R2反應(yīng)器中，此細菌含量增幅最大（由0.9%增加到最大11.95%）。

圖8 R1細菌群落的變化

圖9 R2細菌群落的變化

圖10 R3細菌群落的變化

2.4.2 古菌

首先，從圖11～13 中很容易發(fā)現(xiàn)，3 個厭氧消化實驗啟動之后， 除了甲烷嗜甲基菌科（Methanomethylophilaceae），古菌群落的含量相比于原始接種物中古菌的含量都有明顯下降。原因可能是多數(shù)微生物在這個過程中需要時間去適應(yīng)周邊的生存環(huán)境。隨著實驗的進行，R1 反應(yīng)器中甲烷微菌科（Methanomicrobiaceae）的含量明顯降低，最終有小幅度的提升（由14.98%降到最低1.38%，后回升到10.32%）；在R2 與R3 反應(yīng)器中，甲烷微菌科的變化趨勢與此類似，并且更加顯著。在厭氧消化實驗進行的前后階段，不管是R1、R2還是R3反應(yīng)器，甲烷桿菌科（Methanobacteriaceae）的含量變化是最大的。因為甲烷桿菌是以甲烷為特異性代謝產(chǎn)物的細菌，是整個厭氧消化產(chǎn)甲烷過程順利進行的關(guān)鍵細菌之一。從3個圖中可以看到，在實驗開展后，第3次取樣的測試結(jié)果（R1-3、R2-3、R3-3）顯示甲烷桿菌的含量有一定程度的下降，這也與那段時間產(chǎn)甲烷速率緩慢相對應(yīng)。另外，R3 中甲烷桿菌科（Methanobacteriaceae）的含量在同階段的3個反應(yīng)器中是最大的。甲烷八疊球菌科（Methanosarcinaceae）的含量只有在第3、第4次取樣的階段，含量明顯高于原始接種物，3個反應(yīng)器變化情況類似。并且在前3 周，R2 反應(yīng)器中的甲烷八疊球菌的含量比其他兩組更有優(yōu)勢。這種菌是已知的可以作為種間直接電子傳遞（DIET）中電子受體的古菌，它的存在能夠加快微生物群落間的電子傳遞效率，增加底物的降解速率[37]。所以推測原因是在此階段，首先是易降解的成分大量被降解，之后剩余難降解的木質(zhì)素等物質(zhì)再緩慢的分解，依靠甲烷八疊球菌加快剩余成分的降解速率，導(dǎo)致最終原料的累計產(chǎn)甲烷量有所提高。甲烷嗜甲基菌科（Methanomethylophilaceae）是一種嚴格好氧的革蘭氏陰性菌桿菌，專性甲基營養(yǎng)菌。所以在接種物加入反應(yīng)器中之后，依靠秸稈空隙間的氧氣，甲烷嗜甲基菌科（Methanomethylophilaceae）的含量開始增加，隨著整個反應(yīng)器中氧氣含量降低，它逐漸減少甚至消失。圖13也說明R3相比于R1和R2，較快地達到了完全厭氧的條件，這也與R3混合原料中秸稈含量最少有關(guān)。

圖11 R1古菌群落的變化

圖12 R2古菌群落的變化

圖13 R3古菌群落的變化

2.4.3 微生物多樣性分析

根據(jù)微生物群落分析的數(shù)據(jù)結(jié)果，得到的樣品中物種多樣性指數(shù)如表3所示。其中Chao指數(shù)反映的是微生物群落的豐富度，用來估計物種的總數(shù)。Shannon 指數(shù)反映的是群落的多樣性?？傮w來看，細菌群落的豐富度和多樣性都遠高于古菌。相比于接種物，3個反應(yīng)器中細菌群落的豐富度和多樣性有不同趨勢的波動。第2周、第3周取樣的結(jié)果顯示，R1 和R3 中微生物的豐富度和多樣性都比較低，R2 中微生物的豐富度和多樣性都高于其他兩組。說明相比于R1和R3，R2依靠細菌群落的優(yōu)勢可以快速啟動原料的水解過程，這或許也是其產(chǎn)氣效果較好的一個原因。對于古菌群落，在取樣的4周時間里，3組反應(yīng)器中微生物群落的豐富度和多樣性都是先不同程度的下降，之后有增加的趨勢。對比發(fā)現(xiàn)，R2 反應(yīng)器中整體的古菌群落豐富度和多樣性處于較高的水平，并且變化比較平穩(wěn)。這樣的古菌群落變化過程有利于實驗過程產(chǎn)氣和體系平穩(wěn)運行。

表3 樣品中微生物的多樣性指數(shù)

3 結(jié)論

使用回流式高固厭氧消化反應(yīng)器進行間歇性噴淋實驗，結(jié)果如下。

（1）秸稈與豬糞的最佳配比為2∶1，此時甲烷的產(chǎn)量相對較大，為131.81mL/gVS，在實驗啟動的前3 周，甲烷八疊球菌（Methanosarcinaceae）的相對含量較高，實驗體系中細菌和古菌群落的豐富度以及多樣性都優(yōu)于其他兩組。

（2）混合原料中豬糞含量較大的實驗組，甲烷桿菌（Methanobacteriaceae）的相對含量比較高。

（3）對于高固厭氧消化反應(yīng)，此間歇性滲濾液回流能夠在節(jié)能增效的前提下，縮短厭氧干發(fā)酵的啟動期，提高產(chǎn)甲烷效率。