畢雪源，查曉明

(中國藥科大學(xué) 工學(xué)院，江蘇 南京 211198)

在含氧代謝過程中，需氧生物產(chǎn)生各種活性氧(ROS，reactive oxygen species)?；钚匝醢ǔ趸?O2·-)、臭氧(O3)、脂質(zhì)過氧自由基(ROO·)、單線態(tài)氧(1O2)、次溴酸/次溴酸鹽(HOBr / BrO-)、次氯酸/次氯酸鹽(HOCl / ClO-)、一氧化氮(NO)、羥基自由基(·OH)，過氧亞硝酸鹽(ONOO-)、過氧化氫(H2O2)等[1-3]。H2O2是最重要的活性氧家族之一，對許多生理和病理過程具有重要的調(diào)節(jié)作用，包括細胞信號傳導(dǎo)，調(diào)節(jié)細胞增殖，免疫防御機制，細胞凋亡，遷移和分化等過程[4-12]。在細胞中，H2O2主要是通過激活煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adeninedinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶復(fù)合物在線粒體中產(chǎn)生的，但也源自內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)和各種氧化酶[13-16]。重要的是，細胞內(nèi)不同濃度的H2O2會極大地影響其生物學(xué)功能。通常情況下，健康細胞中H2O2的生理濃度范圍為1到105nM[17]。H2O2的過量積累可能對身體有害，從而導(dǎo)致一系列疾病，例如癌癥，炎癥和細胞損傷[18-20]。低生理濃度的H2O2可以觸發(fā)細胞凋亡并促進氧化應(yīng)激。H2O2在生物系統(tǒng)中起著不可或缺的作用[21]。因此，有必要開發(fā)有效的方法來靈敏地檢測各種條件下H2O2的濃度和分布。

最近，已經(jīng)報道了許多檢測H2O2的方法，包括熒光標(biāo)記法、電化學(xué)傳感器、分光光度法、化學(xué)發(fā)光法、滴定法、色譜法、光檢測法[22-28]。其中，熒光標(biāo)記法具有更多的優(yōu)點，包括優(yōu)異的選擇性、良好的靈敏度、方便的應(yīng)用、低成本、實時和可視化的特點。因此，研究人員將注意力集中在開發(fā)用于對人類健康和臨床前診斷進行H2O2成像的熒光探針上。近來，許多基于芳基硼酸酯或苯基硼酸氧化反應(yīng)的熒光探針已被設(shè)計用來監(jiān)測活細胞和組織中的H2O2，因為它們對H2O2的選擇性性高于其他ROS。早在1957年，就在水溶液中研究了H2O2對芳基硼酸的傳感機制(圖1)。親核的H2O2進攻親電的芳基硼酸酯形成不穩(wěn)定的中間體，該中間體水解后可定量生成苯酚和硼酸[29]。由于H2O2的功能在很大程度上取決于亞細胞區(qū)室?？紤]到這些需求，設(shè)計并合成了一些具有細胞器靶向能力的H2O2熒光探針。

圖1 基于芳基硼酸酯官能團的熒光探針對H2O2的識別機理

2 具有細胞器靶向的熒光探針研究進展

線粒體是重要的細胞器，被認為是活細胞中H2O2的主要來源[30-31]。因此，開發(fā)了線粒體靶向的H2O2探針，用于H2O2的定量分析。由于線粒體膜的電勢通常為-180 mV，帶有陽離子的染料可以很容易地穿透線粒體膜，然后在其內(nèi)部積累[32]。帶正電的基團，例如三苯基磷基團(triphenylphosphonium，TPP)(圖2)，氮正離子和氧鎓離子(圖3)表現(xiàn)出優(yōu)異的線粒體靶向特征。2008年，Chang等人以帶正電的作為靶向基團，設(shè)計了第一個線粒體定向的H2O2熒光探針1[33]。1能夠?qū)Ω鞣N哺乳動物細胞線粒體中H2O2的水平變化進行成像，以及監(jiān)測到帕金森氏病的氧化應(yīng)激模型引起的H2O2水平升高。

Wong等人設(shè)計并合成了一種基于咔唑熒光團和TPP的新型雙光子(two-photo，TP)熒光“開啟”探針2[34]，用于線粒體H2O2檢測。它不僅表現(xiàn)出在15分鐘內(nèi)的快速響應(yīng)和1.96 nM的低檢測限(limitof detection，LOD)，而且還具有比其他ROS更高的選擇性。共定位實驗表明，2在HeLa細胞中選擇性定位于線粒體，Pearson共定位系數(shù)為0.925。2可以檢測深度為105 mm的細胞和組織中的H2O2，具有出色的成像能力。

圖2 基于三苯基磷的線粒體定位H2O2探針

在2019年，基于分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(intramolecular charge transfer，ICT)的熒光探針3被報道[35]，用于檢測線粒體H2O2，其熒光強度變化為120倍，斯托克斯位移(93 nm)。細胞實驗證明探針3具有極好的線粒體靶向和檢測內(nèi)源性H2O2的能力，還可以監(jiān)測(m-chlorophenylhydrazone，CCCP)在線粒體定向凋亡過程中H2O2水平的變化。

TPP的毒性是生物學(xué)應(yīng)用關(guān)注的問題，因此，相繼開發(fā)并應(yīng)用了其他具有氮正離子或氧鎓離子的靶向部分。Shao和他的同事提出了一種新穎的“打開”熒光探針4[36]，該探針引入了咔唑基團作為熒光團，對-頻哪醇硼芐基部分作為對H2O2的識別位點以及具有氮正離子的季銨化的喹啉單元，既是線粒體靶向載體，又是水溶性基團。探針4表現(xiàn)出良好的水溶性，合適的靈敏度(LOD=40 nM)，高選擇性和在5分鐘內(nèi)對H2O2的快速響應(yīng)。探針4在細胞成像中具有線粒體靶向，可以成功地監(jiān)測HeLa細胞中外源性和內(nèi)源性H2O2的水平變化。

Lin課題組開發(fā)了一種新穎的“關(guān)閉”熒光探針5[37]，該探針具有較大的斯托克斯位移(170 nm)。它實現(xiàn)了對H2O2的高度選擇性檢測。探針5顯示出優(yōu)異的線粒體靶向特性，并且可以在活的RAW 264.7細胞中感知外源性和內(nèi)源性H2O2。

Zhang等人構(gòu)建了一種新型的線粒體靶向比例型熒光探針6[38]，該探針由香豆素作為熒光團和硼酸酯部分作為反應(yīng)位點組成。當(dāng)加入H2O2時，化合物6的發(fā)射比率(I535 / I640)表現(xiàn)出良好的線性?；衔?顯示出合適的靈敏度(LOD = 10 nM)，高選擇性。此外，該探針具有良好的線粒體靶向能力，可通過比例熒光成像用于監(jiān)測NRK細胞中的H2O2。

2018年，Song課題組利用ICT和激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移(Excited-State Intramolecular Proton Transfer，ESIPT)機制的結(jié)合，設(shè)計并合成了一種用于H2O2的新型比例熒光探針7[39]。加入H2O2后，探針7表現(xiàn)出顯著的比例熒光變化(I594nm/ I666nm)，并且顯示出較大的斯托克斯位移變化(152nm)。此外，該探針顯示出優(yōu)異的線粒體靶向特性(Pearson共定位系數(shù)= 0.94)，并且可以檢測活HeLa細胞中的外源性和內(nèi)源性H2O2。

Tang等人在2018年開發(fā)了一種基于ESIPT機理的線粒體靶向的近紅外(near-infrared，NIR)發(fā)射熒光探針8[40]，用于比例檢測H2O2。該探針具有大的斯托克斯位移(357 nm)，對H2O2具有高選擇性和敏感性。在沒有H2O2的情況下，該探針在539 nm處顯示出弱發(fā)射帶。加入H2O2會導(dǎo)致539 nm處的發(fā)射消失，而新的發(fā)射帶以669 nm為中心增加。探針8的強度比(F669 / F539)與H2O2的濃度表現(xiàn)出良好的線性相關(guān)性(R2=0.9941)。探針8是線粒體靶向的，已應(yīng)用于活A(yù)549細胞中外源性和內(nèi)源性H2O2的成像。

在2020年，Huang及其同事提出了一種新型的比例熒光探針9，該探針可選擇性檢測活細胞中的線粒體H2O2[41]。將硼酸芳基酯直接與熒光團通過簡單的合成結(jié)合，即可構(gòu)建探針9。ICT機制被芳基硼酸酯與熒光團直接偶聯(lián)所抑制。在加入H2O2之前，在395 nm激發(fā)時，9的發(fā)射波長為493 nm。然而，在H2O2存在下，9在493 nm處的熒光發(fā)射紅移到562 nm，從而實現(xiàn)了比率檢測。9對H2O2表現(xiàn)出高度的選擇性和敏感性(LOD =0.33μM)，并且可以通過共聚焦顯微鏡對CHO-K1細胞中的線粒體H2O2進行雙通道熒光成像。

Zhou小組構(gòu)建了一個雙光子(two-photo,TP)NIR熒光探針(10)，可通過TP可視化細胞和組織中的線粒體H2O2[42]。10使用苯硼酸作為H2O2反應(yīng)部分，并使用氧鎓離子作為線粒體靶向單元。該探針可以高選擇性檢測H2O2，并且在665 nm處熒光強度增強105倍。10在TP激發(fā)(800 nm)下的活細胞線粒體H2O2和小鼠肝臟組織(深度50～170μm)進行成像。

H2O2是最重要的ROS之一，在堿性環(huán)境中對蛋白質(zhì)，DNA，RNA和酶等生物分子具有更強的攻擊活性，并導(dǎo)致一系列疾病。 Lin組報告了第一個基于硼酸的比率型NIR熒光探針11，用于在堿性條件下檢測H2O2和在體內(nèi)對H2O2成像[43]。11在堿性緩沖液中具有比例熒光成像性能(I720nm / I660nm)和對H2O2的高選擇性。細胞實驗表明，11可以成功地成像HeLa細胞中的外源H2O2，并且可以對PMA刺激的巨噬細胞或EGF刺激的A431細胞中內(nèi)源性生成的H2O2成像。在體內(nèi)成像實驗中，11可以對活體動物中的H2O2進行成像。

圖3 基于氮正離子或氧鎓離子的線粒體定位H2O2探針

越來越多的證據(jù)表明H2O2與細胞凋亡密切相關(guān)，尤其是在線粒體中。然而，在凋亡過程中，很少探索不同隔室中H2O2水平的協(xié)同變化，尤其是在兩個重要的細胞器：線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Cendoplasmic reticulum,ER)。為了解決這個問題，Tang研究小組開發(fā)了兩種新型的細胞器特異性熒光探針，分別為12(圖3)和13(圖4)，可以分別檢測線粒體和ER中的H2O2[44]。12和13可以成功地對細胞凋亡過程中線粒體和ER中的內(nèi)源性或內(nèi)源性H2O2成像。通過12和13的雙重成像，線粒體H2O2的水平首先持續(xù)增加，而線粒體定向凋亡的ER H2O2的水平延遲上升。然而，在ER導(dǎo)向的細胞凋亡過程中，ER是H2O2過量產(chǎn)生的主要部位，并且在線粒體中發(fā)現(xiàn)了H2O2水平的延遲升高。

Lee課題組開發(fā)了另一種ER靶向的近紅外探針14[45]。探針14(圖4)基于苯乙烯基萘二甲酰亞胺硼酸酯作為H2O2識別位點來檢測細胞內(nèi)H2O2。加入H2O2后，探針14的熒光強度在535處降低，并在640 nm處熒光增加。14與H2O2的熒光反應(yīng)可在10分鐘內(nèi)完成，溶液中的檢測極限為0.30μM。此外，還發(fā)現(xiàn)在thapsigargin(一種ER應(yīng)激誘導(dǎo)物)的存在時，探針14優(yōu)先積累在Hela細胞的ER中，表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的H2O2水平升高。

圖4 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向的H2O2探針

由于過氧化脂質(zhì)在腦細胞溶酶體中的積累可導(dǎo)致阿爾茨海默氏病，通過與溶酶體亞鐵的主要相互作用，過氧化氫的內(nèi)源性或外源性異常產(chǎn)生可能導(dǎo)致細胞損傷[46]。因此，有效監(jiān)測和檢測溶酶體中的過氧化氫對生理學(xué)和細胞凋亡具有重要意義，因此一系列溶酶體靶向熒光探針被報道(圖5)。Lin等人開發(fā)了靶向溶酶體且快速響應(yīng)(60s)的H2O2熒光探針15[47]，其熒光增強了80倍。該探針具有較高的溶酶體共定位系數(shù)(0.96)同時可以對活細胞中外源性和內(nèi)源性H2O2進行成像，并通過TP顯微鏡可以觀察到深度組織中H2O2的水平。

溶酶體是結(jié)合在膜上的酸性囊泡(pH 4～6)，因此，酸性pH可激活的熒光探針可以更好地檢測和可視化溶酶體中的H2O2，而不會受其他可能的熒光信號干擾[48-51]。2016年，Zhao等人開發(fā)了一種pH觸發(fā)的H2O2響應(yīng)的熒光探針16[52]，該探針可以在溶酶體pH下對細胞內(nèi)H2O2進行響應(yīng)。熒光探針由硼酸酯部分作為H2O2響應(yīng)基團和螺苯并吡喃熒光團作為pH可轉(zhuǎn)換位點組成。對于細胞內(nèi)H2O2檢測，只能明顯地檢測到來自溶酶體區(qū)室的熒光發(fā)射，而其他區(qū)域的熒光發(fā)射則是不可見的，這是由于探針的特定pH觸發(fā)特性引起的。

在2017年，Zhao和他的同事還開發(fā)了另外一個溶酶體定位和酸性pH可觸發(fā)的熒光探針17，用于檢測和可視化溶酶體中的H2O2[53]。該探針由H2O2響應(yīng)基團硼酸酯單元，pH值可激活的苯丙氨酸熒光團和溶酶體定位的嗎啉基團組成。值得注意的是，該探針無需外部刺激即可對HeLa細胞中內(nèi)源性溶酶體H2O2進行熒光監(jiān)測，而來自其他細胞內(nèi)細胞器的信號干擾則可以忽略不計。

圖5 溶酶體靶向的H2O2探針

高爾基體的氧化應(yīng)激與大量ROS的產(chǎn)生和高血壓的進展顯著相關(guān)。值得注意的是，H2O2，作為氧化應(yīng)激的指標(biāo)，對其進行定量檢測對于揭示高爾基氧化應(yīng)激的機制至關(guān)重要。Tang和他的同事開發(fā)了一種TP熒光探針18[54](圖6)，基于靶向高爾基體的新型苯磺酰胺基團在活細胞和腎臟組織中可以對H2O2比例成像。值得注意的是，與不存在H2O2時相比，存在H2O2時F560nm/F470nm的比率增加了130倍。18成功檢測到高血壓小鼠腎臟中H2O2的水平增加。這項工作為揭示高爾基體氧化應(yīng)激與高血壓之間的關(guān)系以及將來治療高血壓的新藥物靶標(biāo)提供了理想的工具。

圖6 高爾基體靶向的H2O2探針

細胞核不僅是活細胞中最關(guān)鍵的細胞器，而且還包含絕大多數(shù)的DNA[55]。異常的ROS可以攻擊細胞核中的DNA，并誘導(dǎo)DNA堿基的氧化修飾，這與衰老，阿爾茨海默氏病和癌癥有關(guān)[56-58]。因此，ROS的核定位探針非常重要(圖7)。2014年，Yi等人構(gòu)建了一種新型的核定位的比率型H2O2熒光探針19，該探針將NP1連接到核定位信號(nuclear localization signal，NLS)肽(VQRKRQKLMP-NH2)上[59]。 NLS肽已經(jīng)被用作有效的核傳遞載體。探針19可用作HeLa細胞中核H2O2的比例檢測。

在2019年，Yin及其同事開發(fā)了一種新的H2O2細胞核可視化探針20，該探針由H2O2熒光傳感器(NP1)和擴展的NLS肽(pep6，CGGGGGVQRKRQKLMP)組成[60]。重要的是，由NP1和pep6組成的探針系統(tǒng)用于對HepG2細胞中刺激后的細胞核H2O2水平進行成像。這種設(shè)計策略可能成為開發(fā)核定位熒光探針的未來設(shè)計方法。

圖7 ROS的核定位探針

3 總結(jié)與展望

我們總結(jié)了線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體以及細胞核靶向的基于硼酸鹽識別的H2O2熒光探針，同時討論了它們的靶向策略、熒光行為及其在生物成像中的應(yīng)用?？傊?，基于硼酸鹽的H2O2局部檢測的探針已經(jīng)取得了很大的進步。但是，靶向細胞器的H2O2熒光探針也有很大的優(yōu)化空間：(1)大多數(shù)報道的基于硼酸鹽的靶向細胞器的H2O2熒光探針的發(fā)射波長通常分布在可見光區(qū)域，進一步開發(fā)具有近紅外發(fā)射的靶向細胞器的H2O2熒光探針，這樣更有助于生物學(xué)研究中的應(yīng)用。(2)由于探針進入特定細胞器所引起的生理狀態(tài)變化可能會導(dǎo)致這些探針從細胞器中逸出。因此，能夠結(jié)合特定細胞結(jié)構(gòu)(包括但不限于蛋白質(zhì)、脂質(zhì)體和DNA)的熒光探針的開發(fā)將提供準(zhǔn)確的定位和更精細的研究。我們深信，這些H2O2熒光探針將成為化學(xué)家、生物學(xué)家和醫(yī)學(xué)科學(xué)家進行疾病診斷和病理生理機制研究的強大工具。