師鐘睿，李偉鑫，張明華

腎病綜合征是指因腎小球濾過膜受損而導致機體內(nèi)大量蛋白質(zhì)從尿液中丟失的臨床綜合征,可分為特發(fā)性和繼發(fā)性兩種[1，2]，具體發(fā)病機制至今不詳。特發(fā)性腎病綜合征(idiopathic nephrotic syndrome，INS)是腎病綜合征臨床診斷的常見類型[3]。一旦診斷及治療不及時，嚴重影響患兒的生存狀態(tài)[4]。病理學診斷是目前INS的金標準[5]，但有創(chuàng)操作、患兒不便配合和穿取位置等原因嚴重影響連續(xù)監(jiān)測。研究表明，miRNA與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關[6-8]，包括特發(fā)性腎病在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生均可導致miRNA的表達紊亂[9，10]。已有研究發(fā)現(xiàn)，腎病綜合征患兒血清 miRNA的表達水平與健康兒童對照組差異明顯，而且miRNA-150及miRNA-30a-5P在INS的發(fā)生過程中具有重要作用[11-13]。因此，本研究擬通過檢測miRNA-150及miRNA-30a-5P在腎病綜合征患兒血清及尿液中的表達水平，旨在為臨床診斷提供更加便捷的途徑。

1 對象與方法

1.1 對象 選取2017-01至2019-12武警特色醫(yī)學中心腎內(nèi)科確診的93例INS患兒作為患兒組，其中男72例，女21例，年齡3～14歲，平均(7.5±4.2)歲。所有患兒均符合全國腎病學會制訂的特發(fā)性腎病的診斷標準(24 h 尿蛋白>50 mg/kg) ，且入院前未經(jīng)任何治療。排除標準：(1)先天性或繼發(fā)性腎病綜合征；(2)其他腎臟疾病及尿路異?；蚋腥?；(3)其他免疫疾病、肝臟及心血管疾病。入院確診后接受激素和其他常規(guī)輔助治療，包括降壓藥、利尿藥等，部分使用環(huán)孢素、環(huán)磷酰胺、他克莫司及麥考酚嗎乙酯等。另選取同期在本院常規(guī)體檢的兒童89例為對照組，女20例，男69例，年齡3～14歲，平均(7.2±3.9) 歲，各項檢查指標均正常。兩組性別、年齡差異無統(tǒng)計學意義，具有可比性。所有入選者法定監(jiān)護人均簽署知情同意書，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準通過。

1.2 方法

1.2.1 主要儀器及試劑 LightCycler96實時熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司);1612-1高速離心機(上海醫(yī)療器械集團有限公司); 日立 7600型全自動生化分析儀。Trizol試劑(美國Life Technologies公司)；氯仿、異丙醇 (上?；瘜W試劑有限公司)； miRNA-150及miRNA-30a-5P探針(美國Applied Biosystem 公司)；RT-PCR反應體系中的其他試劑及反轉(zhuǎn)錄反應體系中的試劑(大連Takara公司)。

1.2.2 標本收集與處理 兩組患兒均取空腹靜脈血3.5 ml和晨尿8 ml。血和尿樣于室溫3000 r/min離心, 10 min。離心后每份血清和尿液標本留取小部分于-80 ℃保存，用于檢測miRNA- 150及miRNA-30a-5P水平。

1.2.3 血清RNA提取 制無菌DEPC處理水，標本常溫下溶解；加入0.2倍體積(200 μl )的三氯甲烷振蕩，室溫靜置3～5 min,15 000 r/min，離心15 min。取上層液相，加入等體積的異丙醇，-20 ℃靜置12 h。15 000 r/min，低溫離心25 min，去上清，沉淀中加入1 ml 75%乙醇，儀器震蕩。15 000 r/min，低溫離心5 min，去上清。

1.2.4 尿液RNA提取 將尿液標本在4 ℃、4000 r/min離心25 min，取500 μl 上清液，根據(jù)試劑盒說明書加入100 μl ExoQuick 試劑，混勻離心后用 Trizol 法從新鮮尿液標本的外泌體中提取RNA，并溶于 20 μl去RNA酶水，凍存于-80 ℃待用。

1.2.5 qRT-PCR檢測 采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。根據(jù)大連Takara公司Prime Script miRNAq PCR Starter Kit Ver 2.0說明書進行。U6基因作為內(nèi)參基因。引物序列miRNA-150：5′-AGAGGGTTGGGAACATGGTCAC-3′;引物序列miRNA-30a-5P：5′-CACTCTCATGTAAACATCCTCGAC-3′;引物序列U6：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′。反應條件為預變性95 ℃, 15 s，1個循環(huán)；PCR反應，95 ℃ 15 s，62 ℃ 30 s，40個循環(huán)；熔解曲線分析，95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s，1個循環(huán)。運用qRT-PCR技術檢測血漿標本中miRNA的相對表達值，每個標本進行3次檢測，取其平均值，以U6為內(nèi)參，結(jié)果采用2-ΔΔCt計算。

1.2.6 尿蛋白和血清學指標測定 采用干化學法測定尿常規(guī)尿蛋白；采用雙縮脲法測定 24 h 尿蛋白；血清 Alb、TP、TC、TG、尿酸、尿素和肌酐采用日立 7600型全自動生化分析儀進行定量檢測。

2 結(jié) 果

2.1 生化指標水平比較 患兒組與對照組血清尿素、肌酐及尿酸水平基本一致，差異無統(tǒng)計學意義。但患兒組蛋白尿、總膽固醇、三酰甘油及尿酸水平顯著高于對照組，而總蛋白和清蛋白含量明顯低于對照組，差異均具有統(tǒng)計學意義(P< 0.05，表1)。

表1 特發(fā)性腎病綜合征患兒組及對照組生化指標水平比較

2.2 血清和尿液中miRNA- 150及miRNA-30a-5P檢測結(jié)果比較 患兒組與對照組在尿液中miRNA-150水平基本一致，差異無統(tǒng)計學意義。但患兒組血清和尿液中miRNA-30a-5P及血清中miRNA-150水平顯著高于對照組，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。且患兒組經(jīng)治療后病情緩解或控制的46例患兒中，血清和尿液中miRNA-30a-5P及血清中miRNA-150水平顯著下降，與之前的水平相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表2)。

表2 特發(fā)性腎病綜合征患兒組及對照組血清和尿液中miRNA-150及miRNA-30a-5P水平比較

2.3 ROC曲線分析(圖1) 患兒血清中miRNA-150和miRNA-30a-5P診斷INS的ROC曲線下面積(AUC) 分別為0.852(95%CI: 0.812～0.892)、0.869(95%CI: 0.901～0.837)；患兒尿液中miRNA-150和miRNA-30a-5P診斷INS的ROC曲線下面積(AUC)分別為0.825(95%CI: 0.783～0.867)、0.833(95%CI:0.804～0.862)。

圖1 特發(fā)性腎病綜合征患兒血液及尿液中miRNA-150和 miRNA-30a-5P ROC曲線A.血清中miRNA-150；B.血清中miRNA-30a-5P；C.尿液中miRNA-150；D.尿液中miRNA-150

3 討 論

目前，INS由于病因及病理類型不同，加之缺乏準確的分子水平診斷及監(jiān)控特異性無創(chuàng)性分子標志物，病理形態(tài)學仍是其診斷的金標準[14]。近年來，隨著分子學的不斷發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)一些新型生物標志物可作為無創(chuàng)性的分子標志物提示INS的發(fā)生及發(fā)展。miRNA作為生物標志物，可能成為INS診斷治療及判斷預后的重要標志物[15]。有研究發(fā)現(xiàn)， miRNA-30a-5p 和 miRNA-30 家族其他成員在腎病患者足細胞中下調(diào)，促進足細胞損傷，并進一步證實 miRNA-30 通過靶向作用于 Notch1 和 p53保護足細胞[16]。同時有學者認為，腎小球損傷的成人腎組織中一些特定miRNA表達失調(diào)[17]。miRNA-150的基因位點在人體染色體19q13.33，通過調(diào)控靶基因引起下游基因的表達發(fā)生變化。南京軍區(qū)總醫(yī)院課題組研究發(fā)現(xiàn)，腎病綜合征患兒血清miRNA-150的表達水平明顯高于健康人[18]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，患兒組血清及尿液中miRNA-30a-5P及血清中miRNA-150水平明顯高于對照組，尿液中miRNA-150水平基本一致。經(jīng)臨床治療后，其中46例病情控制或緩解的患兒血清及尿液中miRNA-30a-5P及血清中miRNA-150水平顯著降低。說明患兒血清中miRNA-150及miRNA-30a-5P可能與INS存在某種內(nèi)在聯(lián)系。通過miRNA-150和miRNA-30a-5P診斷INS的ROC曲線下面積，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血清和尿液中miRNA-150及miRNA-30a-5P水平可在一定程度上反映INS的存在，但對于其發(fā)生及發(fā)展過程乃至愈后的判斷是否有預測作用，因本實驗的設備及相關觀察的限制，未能進行相關的研究，我們將在以后的研究中進行觀察。對于miRNA-150及miRNA-30a-5P在INS患兒腎組織中的表達量是否有變化以及變化方式如何，目前尚無文獻報道。從本研究的患兒血循環(huán)和尿液的檢測結(jié)果推測，miRNA-150及miRNA-30a-5P在患兒腎組織中的表達會有一定的變化。

綜上所述，INS患兒血清及尿液中miRNA-150及miRNA-30a-5P含量明顯升高，經(jīng)治療后水平顯著降低，可能作為輔助診斷INS的良好分子標志物。下一步將針對診斷、治療及預后評估進行更深入地研究。