黃周鋒 胡筱希 陸國壽 黃建猷 譚曉

摘 要 目的：研究檸檬酚對人肝癌HepG2細(xì)胞增殖、遷移及骨架相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，并探討其與骨架相關(guān)蛋白的相互作用方式。方法：采用CCK-8法檢測不同濃度檸檬酚（12.5、25、50、100、200 μmol/L）作用24 h后對HepG2細(xì)胞增殖的影響。將HepG2細(xì)胞分為陰性對照組和檸檬酚低、高濃度組（50、100 μmol/L檸檬酚），加入相應(yīng)藥物作用24 h后，采用劃痕試驗(yàn)檢測細(xì)胞的遷移能力并計算細(xì)胞遷移率，采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和Western blotting法檢測細(xì)胞中聚合纖維狀肌動蛋白（F-actin）、β-微管蛋白（β-tubulin）及埃茲蛋白（Ezrin）的mRNA和蛋白表達(dá)水平。利用分子對接軟件Schrodinger 2015分析檸檬酚與上述3種蛋白的分子作用方式。結(jié)果：檸檬酚對HepG2細(xì)胞增殖具有顯著抑制作用（P<0.05或P<0.01），且呈劑量依賴趨勢。與陰性對照組比較，檸檬酚低、高濃度組細(xì)胞遷移率和F-actin、β-tubulin、Ezrin 的mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05或P<0.01）。分子對接結(jié)果顯示，檸檬酚可與上述3種細(xì)胞骨架蛋白形成氫鍵和疏水鍵。結(jié)論：檸檬酚可抑制肝癌HepG2細(xì)胞的增殖和遷移;其作用機(jī)制可能與下調(diào)F-actin、β-tubulin、Ezrin 的mRNA及蛋白表達(dá)有關(guān);其與骨架相關(guān)蛋白的作用方式可能是形成氫鍵或疏水鍵。

關(guān)鍵詞 檸檬酚;人肝癌HepG2細(xì)胞;增殖;遷移;骨架相關(guān)蛋白;分子對接

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the effects of citrusinol on proliferation， migration and the expression of skeleton-related proteins of human hepatocellular cells HepG2， and to investigate its interaction mode with skeleton-related proteins. METHODS： CCK-8 assay was used to detect the effects of different concentrations（12.5， 25， 50， 100， 200 μmol/L）of citrusinol on the proliferation of HepG2 cells for 24 h. HepG2 cells were divided into negative control group， citrusinol low-concentration and high-concentration groups （50， 100 μmol/L citrusinol）. After treated for 24 h， the migration of HepG2 cells was detected by cell scratch test; cell migration rate was calculated. mRNA and protein expression of F-actin， β-tubulin and Ezrin in HepG2 cells were determined by RT-PCR and Western blotting assay. Molecular docking software Schrodinger 2015 was used to analyze the interaction mode between citrusinol and above 3 kinds of proteins. RESULTS： Citrusinol showed significant inhibition effect on the proliferation of HepG2 cells （P<0.05 or P<0.01）， in dose-dependent trend. Compared with negative control group， cell migration， mRNA and protein expression levels of F-actin， β-tubulin， Ezrin were decreased significantly in citrusinol low-concentration and high-concentration groups （P<0.05 or P<0.01）. Molecular docking results showed that the citrusinol could form hydrogen bond and hydrophobic bond with the above 3 skeleton-related proteins. CONCLUSIONS： Citrusinol can inhibit the proliferation and migration of HepG2 cells， the mechanism may be associated with the down-regulation of mRNA and protein expression of F-actin， β-tubulin and Ezrin. The mode of its interaction with skeleton-related proteins may be the formation of hydrogen bond or hydrophobic bond.

KEYWORDS Citrusinol; HepG2 cells; Proliferation; Migration; Skeleton-related proteins; Molecule docking

肝癌是常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和病死率均很高。近年來研究發(fā)現(xiàn)，從中藥中提取分離的天然有效成分在腫瘤疾病的治療中起到了積極作用[1]。檸檬酚是從壯瑤藥材小槐花中分離得到的活性成分[2]，是一種A環(huán)并吡喃環(huán)黃酮類化合物（化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1）。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，具有A環(huán)并吡喃環(huán)黃酮結(jié)構(gòu)的成分表現(xiàn)出良好的抗腫瘤活性，如桑辛素（Morusin）對人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞和人乳腺癌MCF7、MDA-MB-231細(xì)胞均具有強(qiáng)烈的抗腫瘤活性[3]。由此推測，檸檬酚也可能具有潛在的抗腫瘤活性。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，檸檬酚可以通過破壞人肝癌HepG2細(xì)胞聚合纖維狀肌動蛋白（F-actin）骨架，阻止紡錘體形成，從而抑制人肝癌HepG2細(xì)胞的增殖[4]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)-actin骨架的重組是細(xì)胞黏附能力和細(xì)胞形態(tài)改變得以實(shí)現(xiàn)的關(guān)鍵，當(dāng)藥物干預(yù)后可引起細(xì)胞骨架蛋白解聚，從而導(dǎo)致凋亡的發(fā)生[5-6]。Rao J等[7]的研究表明，細(xì)胞骨架聚合/解聚狀態(tài)的改變，對惡性腫瘤細(xì)胞的形態(tài)和表型有非常重要的調(diào)節(jié)作用，故推測干預(yù)細(xì)胞骨架重組可作為抗癌藥物的作用靶點(diǎn)?；诖?，筆者在前期研究的基礎(chǔ)上，采用CCK-8法檢測檸檬酚對HepG2細(xì)胞增殖的影響，采用劃痕試驗(yàn)檢測檸檬酚對HepG2細(xì)胞遷移的影響，采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）和Western blotting法檢測HepG2細(xì)胞中F-actin、β-微管蛋白（β-tubulin）、埃茲蛋白（Ezrin）的mRNA及其蛋白表達(dá)水平，然后采用分子對接方法考察檸檬酚與上述3種蛋白的相互作用方式，以期為抗腫瘤活性分子的篩選及相關(guān)新藥開發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

BJ-J1606型細(xì)胞培養(yǎng)箱（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）;CKX53型倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）;ATY224型電子天平（日本Shimadzu公司）;Z-11D型超聲波細(xì)胞破碎儀（日本Toshiba公司）;H1850R型臺式高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀天平儀器設(shè)備有限公司）;Multiskan Fc型酶標(biāo)儀、ST70-2型微孔板恒溫振蕩器、7500型熒光定量PCR儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）;Tanon 5500 Multi型全自動化學(xué)發(fā)光/熒光圖像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）;1645050型基礎(chǔ)電泳儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 藥品與試劑

檸檬酚（本實(shí)驗(yàn)室自制，純度：≥98%）;高糖DMEM培養(yǎng)基（美國Hyclone公司，批號：AD12854263）;胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司，批號：18090505）;0.25%胰酶（美國Gibco公司，批號：1967534）;CCK-8試劑盒（日本Dojindo公司，批號：CK04）;兔抗Ezrin、F-actin、β-tubulin、β-actin單克隆抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號：AG12013984、AH11168240、AG07178634、AG0719703）;反轉(zhuǎn)錄試劑盒[紐英倫（北京）生物技術(shù)公司，批號：M0303S];熒光定量PCR試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司，批號：26616）; RIPA裂解液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：P0013B）;BCA蛋白定量試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司，批號：R7204）;辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔免疫球蛋白G二抗（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號：bs-40296G）;3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH，南京捷尼斯生物科技有限公司）;磷酸鹽緩沖液（PBS，pH為7.2～7.4）、青霉素、鏈霉素均購自美國Hyclone公司;無水乙醇、異丙酮、氯仿等均為分析純;其他試劑為實(shí)驗(yàn)室常用試劑，水為超純水。

1.3 細(xì)胞

人肝癌細(xì)胞HepG2購自美國ATCC細(xì)胞庫。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

取HepG2細(xì)胞，置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基（以下簡稱“培養(yǎng)基”）中，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)（以下培養(yǎng)條件相同）。

2.2 細(xì)胞增殖試驗(yàn)

采用CCK-8法進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測。將對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞接種至96孔培養(yǎng)板中，每孔約1×104個細(xì)胞，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，棄上清液，然后將細(xì)胞分為陰性對照組和檸檬酚不同濃度組（終濃度為12.5、25、50、100、200 μmol/L），每組設(shè)置6個復(fù)孔。檸檬酚不同濃度組加入相應(yīng)濃度的含藥培養(yǎng)基，陰性對照組加入等體積培養(yǎng)基。將細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入CCK- 8工作液100 μL，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h后，采用酶標(biāo)儀于450 nm波長處檢測各孔的吸光度（A），并計算細(xì)胞增殖抑制率[細(xì)胞增殖抑制率=（A陰性對照組-A檸檬酚不同濃度組）/A陰性對照組×100%]，再通過SPSS 20.0軟件計算檸檬酚的半數(shù)抑制濃度（IC50）。

2.3 細(xì)胞劃痕試驗(yàn)

將對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，接種于6孔板中，每孔約1×106個細(xì)胞。將細(xì)胞培養(yǎng)至融合率達(dá)95%后，分為陰性對照組和檸檬酚低、高濃度組（終濃度為50、100 μmol/L），每組設(shè)置2個復(fù)孔。用無菌處理后的1 mL槍頭尖端垂直在細(xì)胞表面劃出一條直線，再用PBS沖洗，除去漂浮的細(xì)胞，加入新鮮培養(yǎng)基，于顯微鏡下拍照，記錄劃痕位置。將各孔的上清液吸除后，檸檬酚低、高濃度組加入相應(yīng)濃度的含藥培養(yǎng)基，陰性對照組加入等體積培養(yǎng)基。將細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，置于顯微鏡下拍照，利用 Image J 2.1.4.7軟件分析圖片，并計算細(xì)胞遷移率[細(xì)胞遷移率=（細(xì)胞遷移前的劃痕距離-細(xì)胞遷移后的劃痕距離）/細(xì)胞遷移前的劃痕距離×100%]。

2.4 檸檬酚對細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白mRNA表達(dá)水平的影響

采用RT-PCR法檢測HepG2細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白的mRNA表達(dá)水平。取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，按1×106個/孔接種于6孔板中，分為陰性對照組和檸檬酚低、高濃度組（終濃度為50、100 μmol/L），每組設(shè)置2個復(fù)孔。將細(xì)胞培養(yǎng)至細(xì)胞融合率達(dá)80%后，棄上清液，檸檬酚低、高濃度組加入相應(yīng)濃度的含藥培養(yǎng)基，陰性對照組加入等體積培養(yǎng)基。將細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞，并提取總RNA。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，先將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再按熒光定量PCR試劑盒說明書操作進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序： 95 ℃預(yù)變性2 min;95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，60 ℃延伸30 s，40個循環(huán)。采用熒光分析軟件對產(chǎn)物進(jìn)行分析，并以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算F-actin、β-tubulin、Ezrin mRNA的相對表達(dá)水平。引物信息見表1。

2.5 檸檬酚對細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

采用Western blotting法檢測HepG2細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，以2×106個/孔接種于6孔板中，分為陰性對照組和檸檬酚低、高濃度組（終濃度為50、100 μmol/L），每組2個復(fù)孔。將細(xì)胞培養(yǎng)至細(xì)胞融合率達(dá)80%后，棄上清液，檸檬酚低、高濃度組加入相應(yīng)濃度的含藥培養(yǎng)基，陰性對照組加入等體積培養(yǎng)基。將細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞，加入RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑），提取總蛋白;以BCA法檢測蛋白濃度后，進(jìn)行蛋白變性處理。取變性后蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺電泳（SDS-PAGE），再轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，室溫封閉1 h后，以TBST緩沖液清洗5 min×3次;分別加入β-actin、F-actin、β-tubulin、Ezrin抗體（稀釋比例均為1 ∶ 1 000），4 ℃下孵育過夜;以TBST緩沖液清洗5 min×3次，再加入二抗（稀釋比例為1 ∶ 5 000），室溫孵育1 h;以TBST緩沖液清洗5 min×3次，加入顯色液，以β-actin為內(nèi)參，采用化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)分析蛋白的相對灰度值來表示目的蛋白的相對表達(dá)水平。

2.6 分子對接試驗(yàn)

從PDB數(shù)據(jù)庫（http：//www.rcsb.org/）下載F-actin、β-tubulin、Ezrin的蛋白結(jié)構(gòu)，其PDB ID分別為2ZWH、4U3J、4RM8，采用分子對接軟件Schrodinger 2015中的Schrodinger Maestro模塊中的Prep Wiz功能對蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)處理：加氫、去除水分子、補(bǔ)殘基，使用OPLS3力場對各蛋白進(jìn)行限制能量優(yōu)化，使重原子的坐標(biāo)均方根偏差收斂于0.3 ?[8]。使用Grid Generation模塊定義格點(diǎn)文件，以晶體結(jié)構(gòu)的原有配體所在位點(diǎn)為中心，根據(jù)不同受體定義活性口袋的位置。將“sdf? ? ”格式的檸檬酚結(jié)構(gòu)文件導(dǎo)入Canvas 2.4模塊，導(dǎo)出生成格式為“mae”的文件，再將其導(dǎo)入Maestro 10.2模塊，選擇ligpre模塊自動生成檸檬酚3D結(jié)構(gòu)。將蛋白受體與檸檬酚3D結(jié)構(gòu)在One-Step Glide Docking模塊中進(jìn)行對接，并選擇對接模式為SP，生成2D平面圖。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 檸檬酚對HepG2細(xì)胞增殖的影響結(jié)果

與陰性對照組比較，檸檬酚不同濃度組HepG2細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，其細(xì)胞增殖抑制率均顯著增加（P<0.05或P<0.01）;且隨檸檬酚濃度的增加，其增殖抑制作用越強(qiáng)。檸檬酚對HepG2細(xì)胞的IC50為77.59 μmol/L。檸檬酚對HepG2細(xì)胞增殖的影響見表2。

3.2 檸檬酚對HepG2細(xì)胞遷移能力的影響

與陰性對照組[細(xì)胞遷移率為（92.35±5.36）%]比較，檸檬酚低、高濃度組細(xì)胞遷移率顯著降低（P<0.01），細(xì)胞遷移率分別為（62.48±2.27）%、（48.63±3.25）%，表明檸檬酚能顯著抑制HepG2細(xì)胞的遷移能力。各組細(xì)胞劃痕試驗(yàn)顯微圖見圖2，細(xì)胞遷移率的測定結(jié)果見圖3。

3.3 檸檬酚對HepG2細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白mRNA表達(dá)水平的影響

與陰性對照組比較，檸檬酚低、高濃度組細(xì)胞中F-actin、β-tubulin和Ezrin的mRNA表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。各組細(xì)胞中F-action、β-tubulin和Ezrin的mRNA表達(dá)水平見圖4。

3.4 檸檬酚對HepG2細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

與陰性對照組比較，檸檬酚低、高濃度組細(xì)胞中F-actin、β-tubulin和Ezrin蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.01）。各組細(xì)胞中F-actin、β-tubulin、Ezrin蛋白表達(dá)的電泳圖見圖5，蛋白表達(dá)水平測定結(jié)果見圖6。

3.5 分子對接試驗(yàn)結(jié)果

檸檬酚與F-actin、β-tubulin、Ezrin分子對接的2D平面圖見圖7。由圖7A可知，檸檬酚C-4′位羥基與氨基酸GLU72的側(cè)鏈形成氫鍵;A環(huán)并吡喃環(huán)與氨基酸ARG206形成π-π共價鍵，與氨基酸MET190、TYR188、TYR69、MET269、ASP179、LEU180等形成疏水鍵。由圖7B可知，檸檬酚C-5位羥基與氨基酸ASP128的側(cè)鏈形成氫鍵;C-4位的羰基氧與氨基酸LEU130的側(cè)鏈形成氫鍵，與CYS127、LEU130、ALA124、PHE159等形成疏水鍵。由圖7C可知，檸檬酚C-4′位羥基與氨基酸ASP261的側(cè)鏈形成氫鍵，與ALA264等形成疏水鍵;C-3位羥基與氨基酸Glu244的側(cè)鏈形成氫鍵。

4 討論

檸檬酚于1987年在柑橘屬植物酸橘（Citrus nobilis Lour Var. sunki Hort）中首次被發(fā)現(xiàn)[9]。尚明英等[10]在小檗科植物鬼臼（Podophyllum ecodi Wall.）的干燥成熟果實(shí)小葉蓮中也有發(fā)現(xiàn)該化合物。Shen CC等[11]在豆科植物排錢樹[Phyllodium pulchellum （L.） Desv.]中也發(fā)現(xiàn)有檸檬酚，并報道了其對KB、HepG2細(xì)胞均具有抑制活性。另有研究在毛排錢草（Desmodium blandum Van Meeuwen）中也發(fā)現(xiàn)了檸檬酚，并對其進(jìn)行抗腫瘤細(xì)胞試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其對KB、HepG2細(xì)胞的IC50值分別為14.9、15.2 μg/mL[12-13]。由此可知，檸檬酚具有明顯的抗腫瘤細(xì)胞的活性。本試驗(yàn)結(jié)果也顯示，檸檬酚可以有效地抑制HepG2細(xì)胞的增殖和遷移。

F-actin是細(xì)胞骨架中微絲的主要存在形式之一，肌動蛋白微絲的破壞有可能導(dǎo)致間隙連接數(shù)目減少，細(xì)胞通訊功能下降，進(jìn)而影響細(xì)胞的生長、增殖及其他代謝活動，促使細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化[14-15]。β-tubulin是β微管蛋白中最重要的亞型之一，參與腫瘤細(xì)胞的定向遷移、增殖分化等過程，在細(xì)胞核周圍的微管發(fā)生解聚可以激活Rac/Rho，促進(jìn)細(xì)胞體中微絲的收縮;Ezrin介導(dǎo)“配體（細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)）-黏附分子-Ezrin-細(xì)胞骨架”信號通路參與細(xì)胞的跨膜聯(lián)系和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)節(jié)基因表達(dá)以及細(xì)胞骨架的收縮和組裝，參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[16-18]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，檸檬酚可上調(diào)HepG2細(xì)胞中Ezrin、F-actin及β-tubulin的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞的增殖和遷移。

藥物與蛋白結(jié)合是控制藥物向受體釋放、避免藥物迅速代謝的主要途徑，通過分子對接可以直觀地觀察到藥物小分子與蛋白的結(jié)合方式，有助于從原子水平上了解藥物與生物大分子的作用方式[19-21]。本研究結(jié)果表明，檸檬酚與F-actin、β-tubulin、Ezrin的相互作用模式是形成氫鍵或疏水鍵。

綜上所述，檸檬酚可抑制肝癌HepG2細(xì)胞的增殖和遷移;其作用機(jī)制可能與下調(diào)F-actin、β-tubulin、Ezrin 的mRNA及蛋白表達(dá)有關(guān);其與骨架相關(guān)蛋白的作用方式可能是形成氫鍵或疏水鍵。

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（收稿日期：2020-03-19 修回日期：2020-05-25）

（編輯：唐曉蓮）