王玲彩，董萌萌，王青，杭柏林，劉保國，胡建和，趙坤，徐彥召

(河南科技學院動物科技學院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

鴿子屬于單態(tài)性鳥類，其性別(尤其是在幼鳥時期)在外貌行為上都很難做出判別。和其他鳥類或家禽相比，鴿子屬于“一夫一妻”制的鳥類[1]，在性成熟以后，會有選擇性的尋找配偶，配對成功就不再接受其他異性。但這一特性在實際生產(chǎn)中也成為了一種制約，對產(chǎn)業(yè)化的飼養(yǎng)管理和繁殖育種是極為不利的。因此如何能快速鑒別出鴿子性別就顯得尤為重要。以前，鑒別鴿子性別，多采用一些傳統(tǒng)方法，如觀察鴿子外形、叫聲、腹腔鏡檢查、染色體分析、測定糞便中雌激素與睪酮的比例等方法[2～3]。以上方法雖然也能辨別出鴿子性別，但往往存在準確性不高、操作復雜、成本高昂、對動物傷害較大等缺點，目前應用最多的是利用分子手段對鴿子進行性別鑒定[4]，為鴿子的產(chǎn)業(yè)化養(yǎng)殖奠定了技術基礎。

許多研究表明，鴿子的性別是由Z染色體和W染色體決定的，其中ZZ為雄性，ZW為雌性[1,5]。目前，鑒別鴿子性別應用最多的是CHD基因，原因在于它的進化速率緩慢且保守[6]。CHD-Z和CHD-W為CHD基因在非平胸鳥類中的2個同源拷貝，其外顯子在序列和大小上極其相似，而內(nèi)含子的長度卻相差很大[7]，由此導致該基因在2條性染色體上的長度也不同，證明了利用CHD基因能夠準確地對鴿子進行雌雄鑒定[8]。因此，根據(jù)內(nèi)含子兩側(cè)的保守序列來設計特異性引物，對CHD基因片段進行特異性的擴增，即可實現(xiàn)對鴿子的性別鑒定。

本試驗通過血液樣本提取鴿子的基因組基因，利用2550F/2718R引物，對CHD基因的特異性片段進行擴增，并將PCR產(chǎn)物純化后回收目的片段，回收片段與VecterPMD-19T相連接，然后轉(zhuǎn)入感受態(tài)細胞，對轉(zhuǎn)入后的菌液進行PCR鑒定，并將呈陽性的克隆進行序列測定，通過DNASTAR進行序列比對，從而獲得了鴿子CHD基因的具體序列，增加了性別鑒定試驗的準確性。

試驗在對PCR程序的退火溫度進行優(yōu)化的過程中，發(fā)現(xiàn)雌性鴿子600 bp處條帶易受PCR退火溫度影響，而400 bp處條帶穩(wěn)定，或也可作為鴿子性別鑒定的一種方法。

1 材料與方法

1.1 血液樣本與主要試劑

血液樣本采自河南某鴿場。取已知性別的2羽雄鴿和2羽雌鴿，分別采集翅下靜脈血100～200 μL；隨機取23羽性別未知的健康雛鴿，分別采集翅下靜脈血100～200 μL，用于性別鑒定。采集好的血液樣本均用抗凝劑處理，-20 ℃冷凍保存。

血液基因組DNA提取試劑和抗凝劑為本實驗室自制，PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒購自新鄉(xiāng)智寶科儀儀器有限公司，2×TaqPCR Master Mix購自康為世紀生物科技有限公司，DL-2000 DNA Marker購自北京百泰克生物技術有限公司。

1.2 鴿子基因組DNA提取與質(zhì)量檢測

取鴿子全血，加入適量抗凝劑，獲得鴿子抗凝血；將100 μL鴿子抗凝血加入250 μL裂解液中，用渦旋儀充分混勻，于58 ℃水浴鍋中放置20～30 min，獲得鴿子裂解血；將鴿子裂解血加入600 μL分離液中，渦旋混勻，于76 ℃水浴鍋中放置20～30 min后，以4 000 r/min離心分離10～15 min，取200 μL上清液轉(zhuǎn)移到另一干凈EP管中，獲得鴿子分離血；在鴿子分離血中加入400 μL析出液，以4 000 r/min離心分離1～2 min,留沉淀，加入600 μL洗滌液后渦旋混勻，獲得鴿子初級DNA提取液；將鴿子初級DNA提取液于4 000 r/min離心機中離心分離1～2 min;小心棄上清，收集沉淀室溫干燥，加入30～50 μL ddH2O溶解沉淀，即得鴿子DNA提取液。使用紫外分光光度計對DNA的濃度進行測定，并通過分析OD260/OD280比值來判斷DNA的純度。

1.3 設計與合成引物

根據(jù)文獻報道，選擇1對引物[6]。引物是由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，上游引物為2550F：5′-GTTACTGATTCGTCTACGAGA-3′;下游引物為2718R：5′-ATTGAAATGATCCAGTGCTTG-3′。引物進行PCR擴增，擴增1條帶為雄性，擴增2條帶則為雌性。

1.4 已知性別鴿子的PCR擴增

用1.2所提取的DNA(已知鴿子性別)為模板，2550F、2718R為引物進行擴增。

PCR反應體系：體積為20 μL。2×TaqPCR Master Mix 10 μL，ddH2O 7 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，待檢菌液1 μL。

PCR反應程序：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，51 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共39個循環(huán)；72 ℃終延伸8 min。取PCR產(chǎn)物5 μL進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 未知性別鴿子的PCR擴增

用1.2所提取的DNA(未知鴿子性別)為模板，2550F、2718R為引物進行擴增。PCR反應體系與程序如1.4，反應結(jié)束后取PCR產(chǎn)物5 μL，進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6 不同退火溫度對雌雄鴿子條帶的影響

其他反應條件相同的情況下，將退火溫度設為49～59 ℃進行梯度PCR反應。取5 μL PCR擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，并進行結(jié)果分析。

1.7 性腺觀察與PCR檢測的比對分析

取1.5中進行PCR擴增的鴿子進行解剖并觀察性腺，發(fā)現(xiàn)睪丸為雄性，發(fā)現(xiàn)卵巢、輸卵管則為雌性；最后，將通過PCR進行性別鑒定的結(jié)果，與解剖后觀察性腺得到的性別結(jié)果作比較，以此來驗證采用PCR方法的準確性。

1.8 PCR產(chǎn)物克隆、測序及比對分析

分別取雌、雄鴿子的DNA各1條作為模板進行反應。PCR反應體系50 μL，包含2×TaqPCR Master Mix 25 μL，上下游引物各 1 μL，模板 1 μL，ddH2O 22 μL。PCR反應條件與1.4中相同。取擴增產(chǎn)物，經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳30 min，用凝膠成像儀進行拍照記錄。將雌、雄鴿子PCR產(chǎn)物分別進行切膠，隨后將目的片段用DNA純化回收試劑盒進行純化回收，用回收產(chǎn)物與VectoerPMD-19T相連接，然后轉(zhuǎn)入E.coliK12感受態(tài)細胞，將轉(zhuǎn)化后的菌液用三角涂布棒均勻的涂布在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)；次日挑取單克隆于空白LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)6 h，隨后將培養(yǎng)的菌液進行PCR鑒定并將陽性克隆送往生工生物工程(上海)股份有限公司進行序列測定，并通過DNASTAR軟件將所獲序列在Blast中進行序列比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 已知性別的鴿子PCR擴增

對已知性別的鴿子進行PCR擴增，結(jié)果見圖1。鴿子血液樣品進行PCR擴增后，雄性個體在600 bp左右出有1條亮帶,而雌性個體有2條亮帶，分別在約400 bp和約600 bp處。

2.2 未知性別的鴿子PCR擴增

對23羽未知性別鴿子進行PCR擴增，結(jié)果見圖2。所有雄性個體均顯示為1條帶，而雌性個體均為2條帶。

M.DL2000 Marker；1、2. 雄性鴿子DNA；3、4. 雌鴿子DNA；5. 空白對照圖1 已知性別鴿子CHD基因的PCR擴增

M.DL2000 Marker;1～23. 性別未知鴿子DNA;24. 空白對照；2條帶者為雌鴿，1條帶者為雄鴿圖2 性別未知鴿子CHD基因的PCR擴增

2.3 不同退火溫度對雌雄鴿子條帶的影響

在對退火溫度優(yōu)化的過程中，發(fā)現(xiàn)在600 bp處，雌鴿子的條帶較雄鴿子的條帶更易受退火溫度影響，而雌鴿400 bp處條帶則未受影響，如圖3所示。

2.4 性腺觀察與PCR檢測的比對分析

取經(jīng)過PCR鑒定的23羽鴿子進行解剖，發(fā)現(xiàn)白色睪丸(圖4右箭頭所示)為雄性，發(fā)現(xiàn)卵巢、輸卵管(圖4左箭頭所示)則為雌性；這23羽鴿子中，雄性為14羽，雌性為9羽。將解剖結(jié)果與PCR檢測結(jié)果逐一對比，結(jié)果顯示，通過PCR進行性別鑒定的結(jié)果與解剖后觀察性腺得到的結(jié)果完全一致，其準確率100%。23羽鴿子性別PCR檢測結(jié)果和解剖結(jié)果對比見表1，該對比結(jié)果與預測結(jié)果完全一致，達到早期判定鴿子性別的目的。

M.DL2000 Marker; 1～6. 依次為雌鴿在49～59 ℃時的擴增；7～12. 依次為雄性鴿子在49～59 ℃時的擴增圖3 梯度PCR擴增

圖4 雌雄鴿子解剖圖

表1 23羽鴿性別PCR擴增結(jié)果和解剖檢查結(jié)果的比較

2.5 PCR產(chǎn)物克隆、測序及比對分析

測序結(jié)果顯示，雌、雄鴿子PCR擴增產(chǎn)物的回收片段，成功地與VectoerPMD-19T連接，測序峰如圖5所示。將所測序列進行Blast，發(fā)現(xiàn)含有CHD-Z、CHD-W基因。通過去掉序列中的VectoerPMD-19T片段，分別獲得雌、雄鴿子各個片段的具體序列，其中:雄鴿只有1條帶，長度為657 bp；雌鴿為2條帶，長度分別為449 bp和657 bp。

A.雄鴿600 bp片段；B.雌鴿400 bp片段；C.雌鴿600 bp片段圖5 PCR產(chǎn)物測序峰圖

3 討論

鴿子是單態(tài)性鳥類，即雌雄同型，即使在性成熟后，也很難從外觀上區(qū)別出雌雄。而一般家禽，如雞、鴨、鵝等，出生即可以通過翻肛鑒定性別，且準確率高，已經(jīng)在養(yǎng)禽業(yè)中廣泛應用[9]。鴿子作為晚成鳥，不能像一般家禽那樣進行性別鑒定，只能等到5月齡左右才可以鑒定性別，而在平常的養(yǎng)殖過程中，不同用途鴿子的飼養(yǎng)成本也是不同的。如果能盡早鑒定出性別，多余的雄鴿就可以作為乳鴿上市，可以很大程度上節(jié)約飼養(yǎng)成本，提高經(jīng)濟效益[10-11]。

由于鳥類血液中紅細胞含有細胞核，血液中DNA的量比哺乳動物要多，因此國內(nèi)大部分家禽分子研究多采用采血的方法[12]。本試驗采用一種鴿子全血簡便快速DNA提取方法，成功提取了鴿子基因組DNA，該方法不僅簡便易操作，而且試驗成本低廉，并且試驗過程中沒有使用氯仿、酚等有毒、有害的有機溶劑，與傳統(tǒng)的苯酚-氯仿法提取DNA相比，更安全環(huán)保。

由于CHD基因進化速率慢，對于非平胸鳥類非常保守[6]，隨后此基因被廣泛應用于非平胸鳥類性別的分子學鑒定。近年來，許多學者都利用CHD基因成功的對非平胸鳥類進行性別鑒定，不僅過程簡便，而且結(jié)果可靠。本試驗通過PCR技術，對CHD基因進行特異性擴增，成功的鑒定出鴿子性別，這與呂夕超等[1]和張莉等[11]的研究結(jié)果一致。在PCR擴增的基礎上，對獲取的PCR產(chǎn)物進行克隆、測序和序列比對，獲得雌雄鴿子CHD基因各個片段的具體序列，進一步確證了性別分子鑒定方法的有效性和準確性。

本試驗通過對PCR退火溫度的優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)雌性鴿子600 bp處的條帶易受退火溫度影響，400 bp處的條帶則較為穩(wěn)定；雄性鴿子600 bp處的條帶在一定范圍內(nèi)，退火溫度對其并無影響。雌鴿子和雄鴿子在一定退火溫度下，所擴增的條帶存在差異性，不一定表現(xiàn)為雌鴿2條帶、雄鴿1條帶，也可均為1條帶：400 bp處擴增出條帶即為雌鴿，600 bp處擴增出條帶即為雄鴿。研究結(jié)果為鴿子性別的分子學鑒定提供了一種新的參考。