李國華，熊海波，陳寧,2，徐慶陽,2*

(1.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津 300457；2.代謝控制發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室，天津 300457)

酪氨酸是一種人體重要的芳香族氨基酸[1]，在食品、飼料、醫(yī)藥和化工等行業(yè)有廣泛應(yīng)用[2]。它不僅可以調(diào)節(jié)情緒，刺激神經(jīng)系統(tǒng)，還可幫助加快身體新陳代謝，治療慢性疲勞等。人體需要足夠的酪氨酸用以生產(chǎn)多種重要的大腦化學(xué)物質(zhì)，以便于幫助調(diào)節(jié)食欲、疼痛敏感性和人體對壓力的反應(yīng)。酪氨酸作為食品營養(yǎng)強化添加劑，已在乳制食品、肉制食品、烘焙食品、寵物罐頭、動物飼料等方面得到應(yīng)用。

隨著大腸桿菌合成酪氨酸途徑的解析，利用代謝工程技術(shù)構(gòu)建生產(chǎn)酪氨酸的重組大腸桿菌為研究的熱點[3-6]。前期的研究中[7]，本實驗室構(gòu)建一株利用T7啟動子過表達aroGfbr和tyrAfbrtyrB基因的大腸桿菌，T7啟動子需要使用木糖誘導(dǎo)T7-RNA聚合酶的產(chǎn)生，使得T7啟動子控制關(guān)鍵基因的高效表達[8,9]。由于大腸桿菌木糖異構(gòu)酶基因[10](xylA)的存在，在發(fā)酵過程中將會不斷消耗木糖[11]。本文從菌體生長、L-酪氨酸發(fā)酵、糖酸轉(zhuǎn)化率和代謝副產(chǎn)物等方面進行分析，最終選定木糖添加量30 g/L、隨流加葡萄糖一起流加木糖(木糖流加方式三)的方式為最佳方式。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 菌種

大腸桿菌TYR-05(PT7-aroGfbr+PT7-tyrAfbrtyrB+PxylF-T7RNAP+ΔpheLA)：由天津科技大學(xué)代謝工程研究室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，酵母粉[12]5 g/L，檸檬酸2 g/L，(NH4)2SO4·7H2O 2.8 mg/L，MgSO4·7H2O 9 g/L，VB13 mg/L，VH0.5 mg/L，115 ℃滅菌15 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，酵母粉5 g/L，檸檬酸2 g/L，(NH4)2SO44 g/L，K2HPO4·H2O 15 mg/L，MnSO4·7H2O 9 g/L， FeSO4·7H2O 2.5 mg/L， MgSO4·7H2O 1.5 g/L，VB11 mg/L，VH0.5 mg/L，115 ℃滅菌15 min。

1.1.3 儀器與設(shè)備

BT-457電子天平 深圳市博途電子科技有限公司；BIOTECH-5BG發(fā)酵罐 上海保興生物工程設(shè)備有限公司；Aglient 1200高效液相色譜儀 美國安捷倫科技公司；SBA-40ES生物傳感分析儀 濟南延和生物科技有限公司；754PC紫外可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；S-433D全自動氨基酸分析儀 賽卡姆(北京)科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種活化

從-80 ℃冰箱中取出保菌管，于超凈臺上用移液器移取5 μL接種于裝有5 mL LB液體培養(yǎng)基的搖管中，200 r/min、36 ℃培養(yǎng)12～14 h后，取1 mL接種于LB固體培養(yǎng)基的茄形瓶中，并用接種環(huán)涂布均勻，32 ℃培養(yǎng)12～14 h。

1.2.2 種子擴培

用無菌水將大腸桿菌從培養(yǎng)至布滿菌苔的茄形瓶洗下，接種于2 L種子罐中，36 ℃培養(yǎng)6～8 h,取樣待OD600至12～14 h，按照10%的接種量接入裝液量為3 L的5 L發(fā)酵罐。

1.2.3 發(fā)酵

接種后36 ℃發(fā)酵開始，用質(zhì)量分數(shù)為25%的氨水自動控制pH 為7.0，用質(zhì)量分數(shù)為80%的葡萄糖流加控制發(fā)酵罐內(nèi)葡萄糖濃度在2～5 g/L，調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速和通風(fēng)流量，控制溶解氧在20%～40%的范圍內(nèi)[13,14]。

圖1 木糖流加發(fā)酵L-酪氨酸結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Structural diagram of L-tyrosine fermentation by xylose fed-batch method

1.2.4 L-酪氨酸質(zhì)量濃度的測定

發(fā)酵液預(yù)處理：發(fā)酵液用pH 10～12的NaOH溶液稀釋一定倍數(shù)后，0.45 μm膜過濾。

高效液相色譜測定：層析柱：Phenomenex C18 110A(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：1 mL/min的10%乙腈；溫度：30 ℃；檢測波長：230 nm，進樣量：20 μL。

1.2.5 乙酸質(zhì)量濃度的測定

發(fā)酵液預(yù)處理：取發(fā)酵液1 mL于1.5 mL離心管中，13000 r/min離心3 min，上清液適當稀釋過膜備用。

高效液相色譜測定[15]：層析柱：Bio-Rad Aminex HPX-87 h(300 mm×7.8 mm，5 μm)；流動相：0.5 mL/min的0.005 mol/L H2SO4；溫度：30 ℃；檢測波長：210 nm；進樣量：20 μL。

1.2.6 生物量的測定

采用濁度法，即在種子培養(yǎng)和發(fā)酵過程中取培養(yǎng)基樣品，用分光光度計測定600 nm的吸光值，樣品稀釋至0.2～0.8 g/L范圍內(nèi)進行測定，生物量二稀釋后的吸光值×稀釋倍數(shù)。

1.2.7 微生物生長動力學(xué)和產(chǎn)物合成動力學(xué)公式

式中：X表示生物量；t表示時間；p表示產(chǎn)物濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 木糖添加量對重組大腸桿菌生物量和L-酪氨酸發(fā)酵的影響

在酪氨酸發(fā)酵0 h時，一次性向發(fā)酵罐中加入不同濃度的木糖，30 h后發(fā)酵結(jié)束，觀察其對重組大腸桿菌生物量和L-酪氨酸發(fā)酵的影響。在L-酪氨酸發(fā)酵過程中，木糖誘導(dǎo)T7-RNA聚合酶生成，控制T7啟動子高效表達關(guān)鍵基因生產(chǎn)L-酪氨酸時影響顯著，適量添加木糖可以有效地增加酪氨酸含量。

由圖2可知，較低濃度(≤30 g/L)的木糖不會顯著影響大腸桿菌的生物量，OD600為63；當木糖濃度超過30 g/L時，生物量降低了10%，說明過量的木糖會導(dǎo)致菌體代謝負擔較大，影響菌體生長。在發(fā)酵培養(yǎng)基中不添加木糖(木糖添加量為0 g/L)時，L-酪氨酸能力合成較弱，含量為1.57 g/L；隨著培養(yǎng)基中木糖濃度的增大，T7啟動子激活關(guān)鍵基因表達，L-酪氨酸合成途徑被強化，在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入10 g/L的木糖時，L-酪氨酸含量為9.83 g/L，是不加木糖的6.26倍，影響顯著；在木糖添加量為30 g/L時，L-酪氨酸在發(fā)酵結(jié)束時含量為17.5 g/L，生物量OD600為65.4。繼續(xù)增加木糖濃度，L-酪氨酸濃度不再增加。

圖2 木糖添加量對大腸桿菌生物量和L-酪氨酸發(fā)酵的影響Fig.2 Effect of xylose additive amount on Escherichia coli biomass and L-tyrosine fermentation

發(fā)酵結(jié)束時，在木糖添加量少于30 g/L的發(fā)酵液中未檢測到木糖，木糖在發(fā)酵過程中被當作碳源逐漸消耗，導(dǎo)致木糖濃度下降，不能持續(xù)誘導(dǎo)T7啟動子，導(dǎo)致發(fā)酵產(chǎn)L-酪氨酸發(fā)酵水平低；然而當木糖添加量≥30 g/L時，發(fā)酵結(jié)束時仍能檢測到少量木糖，且L-酪氨酸濃度基本維持在17.5 g/L，木糖對T7啟動子誘導(dǎo)作用達到“飽和”?？紤]木糖成本的經(jīng)濟性因素，30 g/L木糖添加量為最合適的濃度。

2.2 不同木糖流加方式對L-酪氨酸發(fā)酵的影響

在發(fā)酵過程前期，通過控制發(fā)酵條件提高生物量，可以縮短發(fā)酵周期。若木糖添加時間過晚，前期誘導(dǎo)表達不充分，產(chǎn)酸過慢，造成發(fā)酵產(chǎn)酸水平低。因此，木糖的添加量和添加時間對L-酪氨酸含量具有較大的影響。本研究選擇了3種木糖流加方式，探究不同流加方式對大腸桿菌生長和L-酪氨酸發(fā)酵的影響。

方式一：發(fā)酵0，10，20 h分別加入木糖30 g/L,共計90 g；

方式二：發(fā)酵0～20 h以1.5 g/(L·h)的速度恒速流加木糖，共計20 h×3 L×1.5 g/(L·h)=90 g；

方式三：木糖與流加葡萄糖同時流加，即90 g木糖和640 g葡萄糖定容至800 mL，流加進入發(fā)酵罐，木糖總量共計90 g。

由圖3可知，木糖的流加方式對大腸桿菌的生長和L-酪氨酸的發(fā)酵產(chǎn)生了重要影響。圖3(A和B)中，木糖流加方式三比方式一和方式二生長速率大，在發(fā)酵5 h達到最大生長速率7.43，最早到達穩(wěn)定期，在發(fā)酵10 h時OD600為63。木糖流加方式三、方式二、方式一依次出現(xiàn)最大生長速度，并且最大生長速度遞減?？梢姡l(fā)酵液中流加誘導(dǎo)劑木糖對大腸桿菌的生長產(chǎn)生一定的抑制。

圖3 不同木糖流加方式對大腸桿菌生長和L-酪氨酸發(fā)酵的影響Fig.3 Effect of different xylose fed-batch methods on the growth of Escherichia coli and L-tyrosine fermentation注：A為生物量；B為生長速率;C為L-酪氨酸濃度;D為L-酪氨酸合成速率。

由圖3(C和D)可知，按照方式三流加木糖生產(chǎn)的L-酪氨酸含量高，發(fā)酵前期L-酪氨酸合成速率略低于方式一和方式二，在7.5 h左右方式三的合成速率接近并超過其他兩種方式，且在發(fā)酵15 h左右達到最大L-酪氨酸合成速率2.38 g/(L·h)，在30 h發(fā)酵結(jié)束時發(fā)酵罐內(nèi)L-酪氨酸含量為33.5 g/L。這是由于按照方式三流加木糖，發(fā)酵過程前期大腸桿菌生物量較少，代謝葡萄糖速率較慢，只有消耗完發(fā)酵底糖后才會流加葡萄糖，造成隨流加糖流加的木糖在發(fā)酵液內(nèi)濃度較低，對大腸桿菌的誘導(dǎo)作用不明顯；在發(fā)酵過程的中后期，按照方式三流加木糖的大腸桿菌優(yōu)先到達平衡期且維持較大的生物量，又有流加木糖的積累效應(yīng)，導(dǎo)致了L-酪氨酸合成速率的大幅增加，明顯超過了方式一和方式二，在30 h發(fā)酵結(jié)束時積累了33.5 g/L的L-酪氨酸。

由于木糖偶聯(lián)葡萄糖流加，有效地減少了菌體的代謝負擔和對菌體生長的抑制效應(yīng)。本研究證實了方式三是一種有效的誘導(dǎo)生產(chǎn)L-酪氨酸方式。

2.3 不同木糖流加方式對糖酸轉(zhuǎn)化率和代謝副產(chǎn)物的影響

重組大腸桿菌在培養(yǎng)過程中往往會產(chǎn)生一定濃度的代謝副產(chǎn)物(尤其是乙酸)[16]，會對菌體生長、發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)生重要影響，最終會使糖酸轉(zhuǎn)化率降低，導(dǎo)致經(jīng)濟效益下降[17]。研究發(fā)現(xiàn)，L-酪氨酸發(fā)酵液的代謝副產(chǎn)物主要是乙酸(HAc)、組氨酸(His)等。由圖5可知，采用方式三流加木糖誘導(dǎo)大腸桿菌生產(chǎn)L-酪氨酸在30 h發(fā)酵結(jié)束時乙酸含量最高達3.2 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率最高達17%，比方式一和方式二乙酸含量分別增加30%和60%，糖酸轉(zhuǎn)化率分別提高31%和75%；木糖流加方式一較方式二乙酸濃度高9.1%。在30 h發(fā)酵結(jié)束時，木糖流加方式二較方式一乙酸含量高，由于在發(fā)酵前期培養(yǎng)基中木糖含量較高，給菌體造成了較大的代謝負擔，葡萄糖快速代謝產(chǎn)生較多的代謝中間體，不能及時用于菌體生長和產(chǎn)物合成，碳源積累導(dǎo)致乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為乙酸[18]。

由圖4和圖5可知，木糖流加方式三乙酸含量過高與發(fā)酵初期細胞比生長速率和細胞攝氧速率有關(guān)[19]，在發(fā)酵前期，細胞攝氧速率隨細胞比生長速率升高，當細胞比生長速率達到一定數(shù)值之后，細胞攝氧速率不再升高，達到上限并成為限制因素，導(dǎo)致乙酸生成。結(jié)合圖3～圖5，隨著乙酸的積累，加速菌體衰老，菌體生長速率、產(chǎn)物合成速率、葡萄糖消耗速率和氨水消耗速率下降，縮短產(chǎn)物合成期，導(dǎo)致發(fā)酵提前結(jié)束。在以后的研究中，控制發(fā)酵前期適當?shù)拇x壓力和細胞比生長速率，有助于抑制乙酸合成，延長產(chǎn)物合成期，防止細胞早衰。

圖4 木糖不同流加方式對比生長速率的影響Fig.4 Effect of different xylose fed-batch methods on specific growth rates

圖5 不同木糖流加方式對糖酸轉(zhuǎn)化率和代謝副產(chǎn)物的影響Fig.5 Effect of different xylose fed-batch methods on conversion rates of glucose and metabolic by-products

另外，采用木糖流加方式三較其他流加方式代謝副產(chǎn)物組氨酸、苯丙氨酸(Phe)、賴氨酸(Lys)、天冬氨酸(Asp)、亮氨酸和精氨酸均有明顯減少，但是組氨酸相對含量較高，可能是木糖代謝強化了HMP途徑，引起組氨酸積累[20]。

3 結(jié)論

酪氨酸作為重要的食品營養(yǎng)強化添加劑，在治療抑郁癥、調(diào)節(jié)情緒、舒緩壓力等方面將日益受到廣泛關(guān)注和應(yīng)用，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-酪氨酸具有廣闊的前途。

研究結(jié)果表明，木糖作為誘導(dǎo)劑對L-酪氨酸發(fā)酵影響顯著，木糖添加量、木糖流加方式對菌體生長、產(chǎn)物合成、糖酸轉(zhuǎn)化率、代謝副產(chǎn)物等方面產(chǎn)生了重要影響。本文首先利用單因素實驗，得出30 g/L的木糖添加量為最適添加量，比不添加木糖的L-酪氨酸含量提高11.1倍；之后探究了不同木糖流加方式對L-酪氨酸發(fā)酵的影響，研究發(fā)現(xiàn)木糖流加方式三(木糖隨流加葡萄糖一起流加)最優(yōu)：在30 h發(fā)酵結(jié)束時發(fā)酵罐內(nèi)含量最高達33.5 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率最高達17%，乙酸濃度達3.2 g/L。比較方式一和方式二，酪氨酸含量分別提高91%和40%，糖酸轉(zhuǎn)化率分別提高55%和28%，但是乙酸濃度較高。