劉丙雨，賈鵬霞，李新月，張萬江，程 江，吳江東，馬雅靜，2

(1.石河子大學新疆地方病與民族高發(fā)病教育部重點實驗室，新疆 石河子 832000；2.石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院檢驗科，新疆 石河子 832000)

結核病是由結核分枝桿菌感染人體導致的一種慢性傳染性疾病。根據(jù)WHO報告顯示，2018年世界新發(fā)結核病例約有1 000萬例，我國是全球30個高負擔國家之一[1]。新疆一直是全國結核病高發(fā)地區(qū)，呈現(xiàn)出高感染、高發(fā)病、農(nóng)村高疫情、年遞減率低的“三高一低”特點[2-3]。王希江等對全疆96個縣市進行時空聚集性掃描，發(fā)現(xiàn)阿克蘇地區(qū)、喀什地區(qū)、和田地區(qū)等地區(qū)聚集性分布最強[4]。本研究以MIRU-VNTR為基礎，采用Luo等建立的12位點基因分型方法[5]，對阿克蘇市及周邊8縣地區(qū)的痰涂片陽性的結核病患者分離培養(yǎng)得到的結核桿菌進行基因分型，并采用比例法對一線抗結核藥進行藥物敏感試驗，了解該地區(qū)結核菌株基因分型和耐藥性及主要傳播方式，為結核病預防及治療提供導向。

1 資料與方法

1.1菌株來源：收集2018年9月～2019年10月新疆阿克蘇地區(qū)第二人民醫(yī)院痰涂片陽性的維吾爾族結核病患者經(jīng)臨床分離培養(yǎng)得到的結核桿菌186株，結核桿菌標準株H37RV購自國家結核病參比實驗室。所有菌株-80℃保存。本次研究經(jīng)過本院醫(yī)學倫理委員會同意。

1.2主要方法

1.2.1藥敏試驗：按照《結核病實驗室檢驗規(guī)程》[6]進行藥物敏感試驗。采用比例法進行藥物敏感試驗，終濃度分別異煙肼0.2 μg/ml、利福平40.0 μg/ml、乙胺丁醇2.0 μg/ml、鏈霉素4.0 μg/ml。耐藥百分比=(含藥培養(yǎng)基的菌落數(shù)/陰性對照培養(yǎng)基的菌落數(shù))×100%。耐藥百分比>1%，表示對該藥耐藥；≤1%，表示敏感。

1.2.2結核桿菌DNA提取：用接種環(huán)從羅氏培養(yǎng)基中挑2滿環(huán)結核分枝桿菌，置于含200 μl生理鹽水的EP管中，金屬浴100℃,60 min后取出，置于冰上5 min，13 000×g,離心15 min，取上清液于1.5 mlEP管中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3基因分型：采用Luo提出的符合我國國情的12位點分型方法[5]，分別是QUB11b、QUB18、QUB26、MIRU26、MIRU31、MIRU40、Mtub21、Mtub04、VNTR2372、VNTR3820、VNTR4120、VNTR3232。采用RD105缺失基因檢測北京型與非北京型，使用北京康為世紀公司生產(chǎn)的TB基因分型試劑盒，PCR反應體系和反應條件及結果判讀參照說明書。

相關定義如下:①簇：不同菌株基因型相同數(shù)≥8個定義為一簇，表示可能與近期傳播有關聯(lián)；獨特基因型為單一基因型，表示該病例可能是內(nèi)源性復燃而得病[8]。②耐藥結核桿菌：患者體內(nèi)感染的結核桿菌對任意一種抗結核藥物產(chǎn)生耐藥。耐多藥結核桿菌：結核患者感染的結核分枝桿菌至少同時對異煙肼和利福平產(chǎn)生的耐藥。

1.3統(tǒng)計學分析：應用SPSS17.0軟件進行數(shù)據(jù)整理及統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗或Fisher確切概率法；以是否成簇為因變量，成簇定義為1，非成簇定義為0，患者信息為自變量，采用多因素Logistic回歸分析，Bio Numerics7.0軟件進行聚類分析。所有檢驗都為雙側檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1藥敏試驗結果：186株結核桿菌總耐藥率為34.9%(65/186)，耐多藥率28%(52/186)。初治患者耐藥率明顯低于復治患者耐藥率，初治患者耐多藥率明顯低于復治患者耐多藥率，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 藥敏試驗結果比較[例(%)]

2.2基因分型與耐藥性相關分析

2.2.1北京型與非北京基因型：北京基因型和非北京基因型在耐藥性方面差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 基因分型與耐藥結果相關分析[例(%)]

2.2.2基因多態(tài)性及分型結果比較：采用12位點基因分型方法，分析不同位點基因多態(tài)性(HGDI)，總分辨率0.998，其中VNTR3820位點分辨率最高(0.913)，MIRU40位點分辨率最低(0.587)。186株分型結果及聚類分析樹狀圖見圖1所示。共產(chǎn)生156種基因型，其中獨特基因型129種，余成27簇，每簇2～3株，共57株，成簇率16.1%。

圖1 結核分枝桿菌MIRU-VNTR基因分型聚類分析樹狀圖

2.2.3菌株成簇(近期傳播)的影響因素分析：經(jīng)單因素分析發(fā)現(xiàn)菌株成簇在年齡、職業(yè)、治療史、耐藥、耐多藥等方面的差異有統(tǒng)計學意義，在性別、吸煙史、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、營養(yǎng)不良史、文化程度、家庭年收入等方面差異無明顯統(tǒng)計學意義。將菌株分型結果是否成簇當作因變量，成簇是1，非成簇是2。將年齡、職業(yè)、治療史、耐藥、耐多藥等可能的危險因素作為自變量納入多因素Logistic回歸模型，使用ENTER法分析。結果顯示耐多藥(OR=12.328，95%CI:5.235～16.875)和治療史(OR=5.718,95%CI:2.914～11.217)是影響患者成簇的獨立危險因素，相比敏感菌株，耐多藥和復治患者更容易成簇即耐多藥和復治是近期傳播的危險因素。見表3。

表3 肺結核患者基因分型與病人臨床資料的影響因素分析[例(%)]

3 討論

不同地區(qū)結核桿菌基因分型及表型耐藥狀況有所不同[9]。本研究發(fā)現(xiàn)阿克蘇地區(qū)菌株成簇率16.1%，成簇提示患者近期可能被同一傳染源感染，說明近期傳播在該地區(qū)結核病的流行中占有一定比例。

結核桿菌在不同省份的分子流行病學研究顯示北京基因型占主導地位，但是否與耐藥性相關尚不明確；阿克蘇地區(qū)也以北京基因型為主，二者于耐藥性上差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，表明該地區(qū)北京型與耐藥性無明顯相關性。此研究結果與北疆地區(qū)[10]、北京地區(qū)[11]、陜西地區(qū)[12]等研究結果一致；不同地區(qū)結核桿菌的耐藥性呈現(xiàn)多樣性，藥敏實驗顯示本地區(qū)總耐藥率34.9%，低于北疆地區(qū)[11](40.35%)，基本和邢臺地區(qū)[13](31.6%)一致。

耐藥是目前治療結核病的一大棘手問題，結合本文研究結果得出耐藥菌株有可能較非耐藥菌株傾向于近期傳播；分析基因型與病例相關資料發(fā)現(xiàn)，在阿克蘇結核病患者中，男女比例1.19∶1，與HortonKC等調(diào)查結果[14]相符。年齡以60歲以上為主，職業(yè)以農(nóng)民為主，與郝艷艷[15]、王希江[4]、王玥[16]等研究結果一致。影響結核桿菌成簇的危險因素，不同地區(qū)研究結果略有差異[9,17]。本研究得出復治和耐多藥是影響結核桿菌成簇的獨立危險因素，因此，加強復治患者健康教育的同時，注重強調(diào)服藥督導的重要性，在加強本地區(qū)結核病的耐藥篩查的同時，注重MDR-TB患者的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，從而最大限度減少耐多藥結核桿菌的產(chǎn)生和傳播。新疆一直是我國結核病高發(fā)地區(qū)，阿克蘇及周邊地區(qū)是新疆結核病高發(fā)的時空聚集地區(qū)之一，從分子流行病學角度了解本地區(qū)結核桿菌成簇情況及影響因素，為結核病的防控提供更多有價值的信息。