王亦如，杜二球

(1.浙江省溫嶺市中醫(yī)院病理科，浙江 溫嶺 317500；2.臺(tái)州市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，浙江 臺(tái)州 318000)

宮頸癌危害女性生殖健康的生殖道腫瘤之一，目前雖可通過篩查技術(shù)早發(fā)現(xiàn)，但其仍未得到很好控制，且發(fā)病率呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)[1]。因此，探討宮頸癌的發(fā)病機(jī)制對(duì)預(yù)防宮頸癌有重要意義。微小蛋白核糖核苷酸(miRNA)是一種長(zhǎng)度較短的單鏈RNA，它能夠通過結(jié)合miRNA的3′-端非編碼區(qū)來調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。miRNA在腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用，如調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、遷移和侵襲等[2]，故分析不同miRNA在宮頸癌中的作用可為宮頸癌防治提供更多信息。研究顯示宮頸癌中微小蛋白核糖核苷酸(microRNA，miR)-135a-5p的表達(dá)上調(diào)可影響信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transduction and activator of transcription，STAT)3、GATA結(jié)合蛋白3，進(jìn)而參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展[3]。部分研究顯示，miR-365作為抑癌基因，其過表達(dá)能減弱癌細(xì)胞的遷移和侵襲[4]，但其在宮頸癌中的研究較少。本研究探討宮頸癌癌組織中miR-365、miR-135a-5p及STAT3的表達(dá)水平，以驗(yàn)證相關(guān)研究結(jié)論，并為宮頸癌診治尋找新的切入點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集浙江省溫嶺市中醫(yī)院2016年1月至2019年6月間收治的132例宮頸手術(shù)切除標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有組織標(biāo)本均病理診斷明確；②術(shù)前未接受放化療、免疫治療等任何抗癌治療；③臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①研究對(duì)象合并其他惡性腫瘤者；②入組前接受其他宮頸治療者。132例組織標(biāo)本中宮頸癌75例(宮頸癌組)、宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)30例(CIN組)、正常宮頸組織27例(對(duì)照組)。宮頸癌組：年齡33～65歲、平均年齡(48.37±8.04)歲。CIN組年齡30～62歲、平均年齡(47.47±8.96)歲。對(duì)照組年齡30～65歲、平均年齡(48.73±8.56)歲。三組年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

取凍存的宮頸組織標(biāo)本，溶解后使用Trizol試劑(Trizol RNA提取試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司)從組織中提取總RNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA純度與濃度，根據(jù)OD260/OD280比值估計(jì)，將符合濃度標(biāo)準(zhǔn)的RNA分裝標(biāo)記，-80℃保存；使用miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA(miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本Takara公司)，按照試劑盒說明配置聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)體系，使用實(shí)時(shí)PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR(PCR試劑盒購(gòu)自上海妍琦生物科技有限公司，實(shí)時(shí)PCR儀為美國(guó)ABI 7500型)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2min、95℃變性10s、55℃退火30s，變性、退火39次。每個(gè)樣品設(shè)置三次重復(fù)孔。miR-365、miR-135a-5p的引物由上海生工生物有限公司合成，均以U6作為內(nèi)參反應(yīng)體系，使用2-ΔΔCt法計(jì)算miRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.2免疫組化SP法

取4%多聚甲醛固定的宮頸組織塊，常規(guī)石蠟包埋、4μm切片，石蠟切片置于烤箱中烤干，然后置入二甲苯中脫蠟、梯度酒精脫水，PBS 5min×2次清洗后在切片上滴加3%過氧化氫溶液去內(nèi)源性過氧化物酶，PBS 5min×3次清洗，甩干后使用pH 6.0枸櫞酸緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，PBS 5min×3次清洗，滴加血清工作液封閉10min后清干，滴加一抗(STAT3單克隆抗體，上海晶抗生物工程公司提供)，4℃冰箱孵育過夜后加入二抗，二氨基聯(lián)苯顯色，蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、干燥后封片，光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)抽取10個(gè)高倍鏡視野觀察細(xì)胞染色情況。

表1 qRT-PCR的引物序列

1.3 評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)

STAT3以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性，染色強(qiáng)度分為無著色、淺黃色、棕黃色和棕褐色，分別計(jì)分0～3分；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分為無陽(yáng)性細(xì)胞、<10%、11%～50%、51%～75%、>75%，分別計(jì)分0～4分；總分=染色強(qiáng)度×陽(yáng)性細(xì)胞占比得分，0～2分為陰性，≥3分為陽(yáng)性[5]。

1.4 觀察指標(biāo)

采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR)檢測(cè)各組miR-365、miR-135a-5p表達(dá)水平，采用免疫組化SP法檢測(cè)各組STAT3表達(dá)水平，分析miR-365、miR-135a-5p及STAT3表達(dá)水平與宮頸癌臨床病理特征間的關(guān)系。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組間miR-365、miR-135a-5p、STAT3表達(dá)水平

三組間miR-365相對(duì)表達(dá)量、miR-135a-5p相對(duì)表達(dá)量比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，進(jìn)一步每?jī)山M間比較發(fā)現(xiàn)宮頸癌組miR-365相對(duì)表達(dá)量均顯著低于CIN組和對(duì)照組(t值分別為2.788、3.457，均P<0.05)，而miR-135a-5p相對(duì)表達(dá)量均顯著高于CIN組和對(duì)照組(t值分別為2.994、3.906，均P<0.05)。CIN組miR-365相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照組(t=2.753，P<0.05)，而miR-135a-5p相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(t=2.805，P<0.05)。此外，三組間宮頸組織中STAT3陽(yáng)性率比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，進(jìn)一步每?jī)山M間比較結(jié)果發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織STAT3陽(yáng)性率均顯著高于CIN組和對(duì)照組(χ2值分別為10.647、71.889，均P<0.01)，而CIN組宮頸組織STAT3陽(yáng)性率顯著高于對(duì)照組(χ2=24.211，P<0.01)，見表2。

表2 各組間miR-365、miR-135a-5p、STAT3表達(dá)水平比較

2.2 各指標(biāo)診斷宮頸癌的ROC曲線

ROC曲線顯示miR-135a-5p、miR-365及STAT3診斷宮頸癌的AUC分別為0.862、0.747、0.644(均P<0.05)，STAT3敏感性最高，miR-365特異性最高，見表3及圖1。

圖1 各指標(biāo)診斷宮頸癌的ROC曲線

2.3 miR-365、miR-135a-5p、STAT3與宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系

腫瘤直徑≤5cm、FIGO分期Ⅰ～Ⅱ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者宮頸組織miR-365相對(duì)表達(dá)量較低(均P<0.05)，而miR-135a-5p相對(duì)表達(dá)量較高(均P<0.05)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同年齡、病理類型、分化程度、宮旁浸潤(rùn)患者miR-365、miR-135a-5p及STAT3表達(dá)水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，不同腫瘤大小、FIGO分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者STAT3比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見表4。

表3 各指標(biāo)診斷宮頸癌的效能

表4 miR-365、miR-135a-5p、STAT3與宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

3.1 miR-365、miR-135a-5p及STAT3與宮頸癌發(fā)生的關(guān)系

宮頸癌的發(fā)生主要與高危型人乳頭瘤病毒(high risk human papillomavirus，HPV)感染相關(guān)，少數(shù)患者經(jīng)CIN最終發(fā)展為宮頸癌[6]。由CIN轉(zhuǎn)變到宮頸癌的過程可長(zhǎng)達(dá)十?dāng)?shù)年，這一轉(zhuǎn)歸是多因素、多步驟的過程。miRNA作為腫瘤生物學(xué)中的核心分子，其對(duì)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控已被證實(shí)是與多種生理、病理過程相關(guān)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)方式[7]。因此，探討miRNAs在宮頸癌發(fā)生機(jī)制中作用，對(duì)篩選高危人群和早期防治有明顯積極意義。miR-135a-5p屬于miR-135家族成員之一，有研究顯示miR-135a-5p在宮頸癌組織中高表達(dá)，還可影響STAT、GTAT蛋白表達(dá)[8]，miR-135a-5p可能在促進(jìn)宮頸癌發(fā)展中起重要作用。而STAT3與HPV感染、CIN進(jìn)展均關(guān)系密切，還參與調(diào)節(jié)惡性腫瘤細(xì)胞周期、增殖與凋亡。除致癌基因外，抑癌基因負(fù)反饋減弱也是惡性腫瘤發(fā)生的重要機(jī)制之一。Chen等[9]學(xué)者的研究顯示，miR-365過表達(dá)在體內(nèi)外均顯著抑制膽管癌生長(zhǎng)，并促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。故本研究探討促癌基因miR-135a-5p和STAT3，抑癌基因miR-365在宮頸癌患者中的影響及其臨床意義。

3.2 miR-365、miR-135a-5p及STAT3異常表達(dá)在宮頸癌發(fā)生中的作用

miR-135a-5p屬于miR-135家族，有文獻(xiàn)指出，miR-135a是調(diào)控腫瘤細(xì)胞侵襲抑制因子表達(dá)的重要基因，且會(huì)影響宮頸癌細(xì)胞的糖酵解和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[10]。本研究結(jié)果顯示，miR-135a-5p在宮頸癌患者和CIN患者中相對(duì)表達(dá)量升高(P<0.05)，且宮頸癌患者miR-135a-5p相對(duì)表達(dá)量顯著高于CIN組(P<0.05)，反映出miR-135a-5p可能參與宮頸癌形成。STAT3表達(dá)水平也表現(xiàn)出相近趨勢(shì)，宮頸癌組STAT3陽(yáng)性率明顯高于其他兩組(P<0.05)，與張少娟等[8]學(xué)者的研究結(jié)論相近。有研究顯示丙肝病毒能通過增加miR-135a-5p表達(dá)，抑制其靶基因表達(dá)，間接促進(jìn)STAT3表達(dá)[11]，這也說明STAT3與miR-135a-5p間存在相關(guān)性。而STAT3在高危型HPV感染者中表達(dá)增高，且高危HPV感染者可激活白介素-6/STAT3通路，通過腫瘤微環(huán)境中自分泌或旁分泌信號(hào)誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的衰老，促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。STAT3通路還在細(xì)胞周期調(diào)控和凋亡中起作用，機(jī)體正常狀態(tài)下其激活相對(duì)快速且短暫，從而維持正常細(xì)胞生理功能，但其表達(dá)異?？沙掷m(xù)性激活，經(jīng)多種途徑導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖及惡性轉(zhuǎn)化[12]。因此，miR-135a-5p過表達(dá)，可通過解除其靶分子對(duì)STAT3的抑制，來調(diào)控STAT3及其信號(hào)通路，參與宮頸癌發(fā)病過程。本研究通過繪制ROC曲線發(fā)現(xiàn)，miR-135a-5p診斷宮頸癌發(fā)病的AUC可達(dá)85%以上，STAT3診斷AUC也在60%以上，但STAT3診斷特異性略低，推測(cè)是由于部分CIN患者也表現(xiàn)出STAT陽(yáng)性。但miR-135a-5p診斷宮頸癌發(fā)病敏感性可達(dá)90%以上，特異性也在65%以上，能較好地鑒別良惡性宮頸病變，最佳臨界值為5.03。在宮頸癌病情進(jìn)展中，miR-135a-5p也發(fā)揮一定作用。本研究結(jié)果顯示，5cm腫瘤者、Ⅲ-Ⅳ期腫瘤者、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者miR-135a-5p表達(dá)水平均更高(P<0.05)。

本組數(shù)據(jù)中，miR-365相對(duì)表達(dá)量在宮頸癌患者中顯著下調(diào)。郭穎等[13]學(xué)者確定E74樣受體4是miR-365在宮頸癌中的靶分子，miR-365表達(dá)下調(diào)，解除對(duì)其的抑制作用，從而促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖和腫瘤形成。MiR-365診斷宮頸癌發(fā)病AUC為0.747，其診斷敏感性和特異性均在70%以上，是實(shí)用性較高的一個(gè)診斷指標(biāo)，最佳臨界值0.94。在生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證中，miR-365通過靶向抑制細(xì)胞周期蛋白和B淋巴細(xì)胞瘤-2來發(fā)揮作用，miR-365下調(diào)會(huì)影響正常細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)惡性轉(zhuǎn)變。同時(shí)，本研究也發(fā)現(xiàn)，miR-365在腫瘤直徑更大者、中晚期腫瘤及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者中表達(dá)水平更低(P<0.05)，說明下調(diào)miR-365也參與宮頸癌病情進(jìn)展。由于本研究缺乏隨訪資料，因此未能評(píng)估m(xù)iR-135a-5p、miR-365、STAT3與宮頸癌預(yù)后的關(guān)系，有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，宮頸癌癌組織中miR-365下調(diào)、miR-135a-5p上調(diào)，STAT3表達(dá)水平高于正常組織，miR-365、miR-135a-5p均與宮頸癌患者腫瘤大小、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，miR-365、miR-135a-5p及STAT3是診斷宮頸癌的有效指標(biāo)。