黃元蘭，李 丹，仲人前

原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis, PBC)是一類好發(fā)于中年女性的器官特異性自身免疫性疾病，以膽管內(nèi)進行性非化膿性炎癥為病理學特征，以抗線粒體抗體(AMA)陽性為血清學特征[1]。持續(xù)的炎癥反應損傷了膽管上皮細胞，導致膽道閉塞和膽汁淤積。長期的膽汁淤積又加重了膽管內(nèi)的炎癥反應，由此形成的“惡性循環(huán)”，最終會引起肝臟的纖維化和肝功能衰竭[2]。

干擾素共分為3種類型，分別為I型、II型和III型。其中，I型干擾素主要包括干擾素-α(IFN-α)和IFN-β，二者主要通過內(nèi)分泌或旁分泌的方式發(fā)揮作用[2]。當I型干擾素與其受體結(jié)合后，可以啟動多個基因的表達。這些基因通常被稱為干擾素誘導基因(ISG)。從I型干擾素與其受體結(jié)合到ISG表達的信號通路被稱為I型干擾素信號通路。以往的研究表明，I型干擾素信號通路亢進是多種自身免疫性疾病的共同特征[3-4]。但是PBC患者I型干擾素信號通路是否亢進仍不明確。

在本研究中，筆者分析了PBC患者外周血I型干擾素濃度以及外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)內(nèi)多個ISG的表達，以分析I型干擾素信號通路是否亢進及是否參與了PBC的發(fā)病機制。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇2012年5-12月于海軍軍醫(yī)大學附屬長征醫(yī)院和長海醫(yī)院確診的38例PBC患者為研究對象(PBC組)。其中：男9例，女29例，平均年齡為51歲。PBC的診斷標準為美國肝病學會2000年推薦的PBC診斷指南[5]。所有的PBC患者均未合并其他自身免疫性疾病、惡性腫瘤和終末期腎病，在血液標本采集前的1個月內(nèi)也無明顯的感染性疾病病史。對照組為同期來該院體檢的患者中選擇了30例健康人群作為對照組。PBC組和對照組的臨床特征見表1。統(tǒng)計分析結(jié)果表明PBC患者的肝酶、膽紅素等指標均較健康個體增高，2組患者在年齡和性別構(gòu)成比上的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究得到了該校倫理委員會的批準，所有研究對象均簽署了知情同意書。

表1 對照組和PBC組患者的臨床特征

1.2 ELISA檢測 于患者接受治療前，抽取患者靜脈血5 ml，以EDTA-K2抗凝。以3 000 r/min(離心半徑r=20 cm)的速度離心10 min分離血漿。將血漿分裝至EP管中，置于-80 ℃保存待測。待所有血清收集完成后，室溫下復融，采用ELISA法檢測血漿IFN-α和IFN-β水平，ELISA試劑盒購自美國R&D公司，實驗操作過程均按照實際說明書進行。

1.3 PCR擴增 采用密度梯度離心法分離受試對象PBMC，之后采用Trizol法提取總RNA，隨后進行逆轉(zhuǎn)錄和聚合酶鏈式反應(PCR)擴增，檢測3個ISG(IFIT3、MX1和OAS1)的表達，所用內(nèi)參為甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)。IFIT3的正向引物序列為AACTACGCCTGGGTCTACTATCACTT，反向引物序列為GCCCTTTCATTTCTTCCACAC；MX1的正向引物序列為GGGTAGCCACTGGACTGA；反向引物序列為 AGGTGGAGCGATTCTGAG；OAS1的正向引物序列為GAAGGCAGCTCACGAAAC，反向引物序列為 TTCTTAAAGCATGGGTAATTC；GAPDH的正向引物序列為CCATCAATGACCCCTTCATTG，反向引物序列為CATGGGTGGAATCATATTGGAAC。每個樣本做3個復孔，Ct值為3復孔的均值。根據(jù)公式ΔCt=[Ct(目的基因)]-[Ct(內(nèi)參基因)]和ΔΔCt=[ΔCt(疾病組)]-[ΔCt(對照組)]，計算2-ΔΔCt，即為疾病組各基因表達量相對于正常組的倍數(shù)[6]。

1.4 統(tǒng)計學處理 以獨立樣本t檢驗或者Mann-Whitney U檢驗比較2組數(shù)據(jù)之間的差異是否具有統(tǒng)計學意義。所有統(tǒng)計學處理過程均在SPSS 17.0 for Windows或GraphPad Prism 6.0中進行。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 PBC患者外周血IFN-α和IFN-β水平分析 如圖1所示，與對照組相比，PBC患者外周血IFN-α和IFN-β水平明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

注：與對照組比較aP<0.01。PBC為原發(fā)性膽汁性肝硬化，IFN為干擾素圖1 PBC組和對照組血清I型干擾素水平比較

2.2 PBC患者PBMC中干擾素刺激基因(IFIT3、MX1和OAS1)的表達分析 如圖2所示，PBC患者PBMC中的干擾素刺激基因(IFIT3、MX1和OAS1)較健康個體明顯增高(均P<0.01)。

注：與對照組比較a，P<0.01。PBC為原發(fā)性膽汁性肝硬化圖2 PBC組和對照組外周血單個核細胞中干擾素刺激基因的表達

3 討論

I型干擾素主要包括IFN-α和IFN-β，其免疫學功能主要是直接抑制病毒的復制，此外還具有重要的免疫調(diào)理作用，可以通過調(diào)節(jié)免疫細胞的方式間接發(fā)揮抗病原體效應[7-8]。I型干擾素生物學效應的發(fā)揮主要是通過干擾素刺激基因來實現(xiàn)的，當I型干擾素與其受體IFNAR結(jié)合后，胞內(nèi)的STAT1和STAT2形成二聚體，并進一步與IRF9組裝，形成了干擾素刺激基因因子3(ISGF3)。ISGF3進入細胞核之后，可以啟動多個基因的表達，這些基因就是干擾素刺激基因。干擾素刺激基因的生物學功能十分廣泛，包括正向或負向調(diào)節(jié)細胞的凋亡、調(diào)節(jié)免疫應答的強度等。I型干擾素反應就是指I型干擾素誘導干擾素刺激基因表達的過程。

I型干擾素反應是把雙刃劍，雖然適當?shù)腎型干擾素反應有助于免疫系統(tǒng)清除病原體，但是I型干擾素反應亢進則會引發(fā)自身免疫性疾病。在本研究中，筆者首先采用ELISA法檢測了PBC患者外周血的I型干擾素(IFN-α/β)水平，發(fā)現(xiàn)PBC患者外周血I型干擾素水平較健康個體明顯增高。同時，筆者還采用了PCR法檢測了PBC患者PBMC中的3個干擾素刺激基因的表達情況，且表達明顯增高，這提示I型干擾素反應亢進是PBC的重要特征。

以往的研究表明，PBC的發(fā)病機制與感染有關(guān)[9]，而感染本身又會活化I型干擾素信號通路。筆者推測，在PBC發(fā)病過程中可能存在如下過程，病原體感染首先導致個體外周血I型干擾素增加，進而活化了I型干擾素反應。I型干擾素反應亢進后導致了肝臟的自身免疫反應，肝臟膽管上皮細胞被免疫系統(tǒng)殺傷后，釋放了較多的自身抗原。這些自身抗原可以進一步導致又進一步促進了免疫反應，導致I型干擾素反應的持續(xù)活化，形成了惡性循環(huán)。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)PBC患者外周血I型干擾素信號通路過度活化，結(jié)合以往關(guān)于I型干擾素信號通路參與自身免疫性疾病發(fā)病機理的研究證據(jù)，提示I型干擾素信號通路是PBC潛在的治療靶點。