尚月麗，楊俊花，劉寧，鄭江平*

(1. 上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，上海 201699；2. 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，上海 201403；3. 河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，洛陽(yáng) 471023)

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)，又叫嘔吐毒素，屬于單端孢霉毒素B型，其毒性小于A型，由于其在小麥等食物中含量大，因此大量的研究集中于DON[1]。DON是由禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)、黃色鐮刀菌(F.culmorum)和雪腐鐮刀菌(F.crookwellense)等霉菌在適宜的溫度和濕度條件下產(chǎn)生的一種次級(jí)代謝產(chǎn)物，是世界上分布最廣泛的真菌毒素之一[2]。大量研究表明，DON在高溫170～350 ℃下熱穩(wěn)定，170 ℃持續(xù)加熱30 min 濃度不減少[3-4]，小麥、燕麥和玉米等糧食作物在加工的各個(gè)環(huán)節(jié)也可能產(chǎn)生DON直接進(jìn)入畜禽飼料和食品中[5]，導(dǎo)致免疫毒性[6]、生殖毒性，引起肝臟、腎臟等器官的組織病理變化，嚴(yán)重影響動(dòng)物的生產(chǎn)性能。目前，全球的飼料生產(chǎn)都飽受霉菌毒素污染的威脅，給畜牧業(yè)生產(chǎn)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失[7]。

肝臟是機(jī)體重要的代謝器官，也是DON毒性作用的主要靶器官[2]。然而DON對(duì)肝臟組織的損傷作用卻存在不一致的報(bào)道，可能與動(dòng)物種屬，暴露劑量，暴露時(shí)間，生理階段，還與病理學(xué)家對(duì)肝臟組織結(jié)構(gòu)的認(rèn)知及采用的病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)[8-10]。本文就肝臟的組織結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，DON對(duì)肝臟組織結(jié)構(gòu)影響，和DON引起的肝組織損傷的半定量評(píng)分做一綜述。

1 肝臟組織結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

肝臟以肝小葉為單位，典型肝小葉的結(jié)構(gòu)為六邊形，中間為中央靜脈，六邊形的六個(gè)角各有一個(gè)匯管區(qū)，包括小葉間靜脈、小葉間動(dòng)脈、小葉間膽管、神經(jīng)和淋巴管及間質(zhì)組織(支持組織)，圍繞者匯管區(qū)外界，有不連續(xù)的肝細(xì)胞組成限制板(limting plate)[11]。肝臟的組織結(jié)構(gòu)看似簡(jiǎn)單，但是經(jīng)過了近150年的研究，我們對(duì)肝臟組織結(jié)構(gòu)的了解仍不夠深入，特別是不同種屬動(dòng)物之間的肝組織結(jié)構(gòu)差異還不清楚，例如豬與大鼠、狗和貓的肝臟組織結(jié)構(gòu)就有很大差異[12-13]，這也增加了肝臟病理研究的難度。

2 DON對(duì)動(dòng)物肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響

2.1 嚙齒動(dòng)物

用含有3種混合毒素污染的小麥飼喂4周齡大鼠，DON含量約為 (80±5)μg/kg，飼喂28 d，結(jié)果沒有發(fā)現(xiàn)DON對(duì)大鼠肝組織形態(tài)的影響[14]。但Alexa等[15]研究發(fā)現(xiàn)，自然污染DON(含量最高為3 390 μg/kg，平均為2 263.1 μg/kg)的小麥(其中玉米赤霉烯酮含量平均為187.74 μg/kg)飼喂2個(gè)月齡的大鼠1個(gè)月，肝臟實(shí)質(zhì)明顯受到損傷，匯管區(qū)結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的毒性反應(yīng)。以上的影響是否由DON引起，是否與DON的劑量有關(guān)？有報(bào)道稱，在大鼠妊娠6～19 d，每天按照體重0.5、1、2.5和5 mg/kg飼喂DON 1次，到妊娠20 d，發(fā)現(xiàn)DON呈劑量依賴性的增加肝細(xì)胞胞漿損傷，從肝小葉3區(qū)到肝小葉2區(qū)都有肝細(xì)胞胞漿發(fā)生損傷性變化(發(fā)生極性變化)[16]，這種變化的描述與后面文章中描述的肝細(xì)胞空泡化一致。Abdel-Wahhab等[17]也發(fā)現(xiàn)，DON能引起匯管區(qū)淤血，匯管區(qū)膽管周圍纖維性增厚，肝細(xì)胞發(fā)生脂肪性空泡化，肝細(xì)胞核濃縮或者凋亡。這些研究顯示，在自然霉菌污染中，單獨(dú)DON能夠引起肝組織病理?yè)p傷。

小鼠上的研究結(jié)果基本都顯示DON對(duì)肝組織產(chǎn)生不同程度的影響。4周齡雌性ICR小鼠飼喂DON(玉米中含量3.1 mg/kg)，黃曲霉毒素(玉米中含量597 μg/kg)和玉米赤霉烯酮(玉米中729 μg/kg)，用這樣的玉米分別以5%和20%的濃度混合到飼料中，飼喂4周，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝小葉中心區(qū)(3區(qū)，中央靜脈周圍區(qū))肝細(xì)胞氣球樣變性(空泡化)和壞死，同時(shí)伴隨有輕微的出血[18]。用DON污染小麥原料(飼料中含量為5.89 mg/kg)飼喂4周齡無妊娠、未產(chǎn)仔的ICR小鼠50 d，病理組織檢查發(fā)現(xiàn)肝臟細(xì)胞發(fā)生嚴(yán)重的空泡化，脂肪肝和輕度的纖維化[19]。這些研究顯示，自然污染的DON毒素能引起肝臟損傷。近年來研究者針對(duì)混合毒素較高含量的DON進(jìn)行單獨(dú)研究。21日齡雄性昆明小鼠每天進(jìn)行1次按照體重500 μg/kg灌服DON，30 d后發(fā)現(xiàn)小鼠肝細(xì)胞發(fā)生脂肪空泡化[20]。對(duì)斷乳7 d后的SPF級(jí)昆明小鼠按照體重0.5 mg/kg DON隔日灌胃，60 d后發(fā)現(xiàn)小鼠肝臟發(fā)生大片脂肪變性(組織切片空泡化)，肝臟上出現(xiàn)局灶性異常壞死區(qū)[21]。這兩篇研究報(bào)道，采用一樣的劑量，動(dòng)物的生理階段類似，后者暴露時(shí)間更久，對(duì)肝臟損傷也更嚴(yán)重，說明DON對(duì)肝臟的損傷可能存在累積效應(yīng)，評(píng)價(jià)安全性可能需要加長(zhǎng)暴露時(shí)間。對(duì)成年雄性C57BL/6小鼠每天用DON分別以1、2.5、25 μg/kg灌胃，連續(xù)10 d后發(fā)現(xiàn)，25 μg/kg組中央靜脈中度擴(kuò)張，單核細(xì)胞浸潤(rùn)，單核細(xì)胞在靜脈血管周圍滲出，肝小葉間間質(zhì)及匯管區(qū)發(fā)生碎片化壞死[22]。8周齡的雄性C57BL/6 J SPF級(jí)小鼠按照體重25 μg/kg DON每天灌胃發(fā)現(xiàn)，灌胃30 d和90 d小鼠肝小葉中央靜脈周圍均有淋巴細(xì)胞積聚[23]。低劑量對(duì)肝臟有累積性損傷，那么低于25 μg/kg 的DON暴露更長(zhǎng)時(shí)間是否存在累積效應(yīng)引起肝損傷，或小鼠是否存在更敏感的生理階段，有待進(jìn)一步探索研究。

2.2 豬

母豬妊娠的35～75 d，每天飼喂自然污染飼料(含DON 4.42 mg/kg和玉米赤霉烯酮0.048 mg/kg)，組織病理學(xué)檢查并沒有發(fā)現(xiàn)母豬和胎豬肝臟受損[24]。同樣有報(bào)道，母豬妊娠35～75 d使用污染飼料，飼料中DON為4.42 mg/kg，也沒有發(fā)現(xiàn)DON對(duì)胎豬肝臟組織形態(tài)的影響[25]。給斷奶仔豬飼喂DON(飼料中含量為1 mg/kg)和玉米赤霉烯酮(飼料中含量250 μg/kg) 飼喂6周，引起肝臟血管增厚、擴(kuò)張[26]。用DON(9.57 mg/kg)和玉米赤霉烯酮 (0.385 mg/kg) 污染飼料從妊娠75 d開始到妊娠110 d，以 2.0 kg/d(妊娠75～85 d)，3.0 kg/d(妊娠86～100 d)和3.5 kg/d(妊娠100～110 d)飼喂母豬，檢測(cè)肝臟組織發(fā)現(xiàn)肝小葉間質(zhì)增厚，肝細(xì)胞發(fā)生脂肪空泡化[27]。以上報(bào)道并不一致，那么混合毒素中DON是否影響肝臟組織結(jié)構(gòu)。單獨(dú)使用DON發(fā)現(xiàn)，在發(fā)情前的豬對(duì)DON比較敏感，能夠引起肝細(xì)胞的空泡化和小葉間間質(zhì)增厚[28]。但是，也有報(bào)道顯示，單獨(dú)的DON并不引起肝臟的病理變化，DON與玉米赤霉烯酮和煙曲霉毒素混合飼喂35日齡斷奶雌性仔豬，飼喂到35 d才引起肝細(xì)胞的脂肪化空泡肝小葉邊緣炎性細(xì)胞浸潤(rùn)[29]。Pestka等[8]指出，豬是對(duì)DON毒性最敏感的動(dòng)物。不過，從目前的研究看，肝臟是否是DON最敏感的器官，仍需進(jìn)一步的研究數(shù)據(jù)支撐。

2.3 禽及其他動(dòng)物

1日齡雌性火雞飼喂含DON 20 mg/kg的飼料，到21 d時(shí)沒有發(fā)現(xiàn)DON對(duì)肝臟的組織損傷[30]。但是，雞胚內(nèi)按照蛋重2 μg/g注射DON，24 h電鏡觀察，檢測(cè)到雞胚肝組織脂滴積聚，48 h檢測(cè)到肝臟空泡化進(jìn)一步增加；出生后再次口服暴露DON，電鏡觀查到脂肪積聚進(jìn)一步增加，類似人的脂肪肝[31]。斷奶德國(guó)荷斯坦奶牛飼喂含DON為5.3 g/kg的干物質(zhì)飼料，11周后肝臟組織活檢，電鏡和光學(xué)顯微鏡檢查，均沒有發(fā)現(xiàn)DON對(duì)肝臟形態(tài)的影響[32]。這些報(bào)道的觀點(diǎn)基本一致，認(rèn)為禽類與豬、狗和貓比不敏感，但是禽類比反芻動(dòng)物敏感[8]。

就目前對(duì)DON引起肝臟損傷的研究總結(jié)來看，對(duì)肝臟的損傷并不像是豬最敏感，嚙齒動(dòng)物次之，而似乎是小鼠最為敏感，25 μg/kg的DON就能夠引起肝臟組織變化。是否存在不同評(píng)價(jià)方法對(duì)結(jié)果的影響還值得研究。

3 DON對(duì)肝臟損傷的評(píng)分

在上世紀(jì)80年代提出了慢性肝炎的半定量評(píng)分體系組織活性指數(shù)(Histological Activity Index，HAI)并在全世界病理學(xué)領(lǐng)域內(nèi)廣泛應(yīng)用。1995年經(jīng)ISHAK等[10]對(duì)應(yīng)用中存在的問題進(jìn)行修改，修改后的HAI能清楚區(qū)分肝炎的分期與分級(jí)，把肝炎的損傷嚴(yán)重性和進(jìn)展程度區(qū)分開來，且較容易操作如表1、2所示[10]，在慢性肝病尤其是引起炎癥壞死的肝臟損傷評(píng)分中得到廣泛應(yīng)用[33-34]。隨著對(duì)DON毒性研究的深入，逐漸由開始的急性高劑量研究轉(zhuǎn)入慢性、低劑量、無癥狀潛在毒性研究，這也是未來DON影響畜牧生產(chǎn)的主要研究方向[1]。有研究者開始將HAI的方法或思想引到DON對(duì)肝臟損傷的病理評(píng)分中并加以完善。

表1 修改HAI的分級(jí)：炎癥壞死評(píng)分

據(jù)報(bào)道，三元雜交豬體重(26.4 ± 4.0)kg飼喂含有DON(3.1 mg/kg)飼料37 d，利用修改的HAI評(píng)分對(duì)肝臟進(jìn)行病理評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)DON不影響肝臟的病理評(píng)分[35]。與之類似，直接利用修改的HAI評(píng)分，研究青年三元雜交豬飼料DON慢性污染，DON (4.59 mg/kg) 暴露4周，也沒有發(fā)現(xiàn)DON對(duì)肝臟HAI病理評(píng)分的影響[36]。但是，小母豬飼喂污染DON/黃曲霉毒素(5∶1)污染的飼料33 d，送病理實(shí)驗(yàn)室對(duì)肝臟進(jìn)行膽管增生、纖維化、水腫性變性、炎癥、巨核細(xì)胞、壞死、空泡化進(jìn)行病理評(píng)分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)毒素顯著增加肝臟的纖維化[37]。雌性1周齡小火雞飼喂自然污染包含DON、玉米赤酶烯酮和黃曲霉素毒素的飼料到6周齡，對(duì)肝臟進(jìn)行病理評(píng)分發(fā)現(xiàn)，毒素顯著增加肝臟的病理分值[38]。以上報(bào)道顯示，混合毒素影響肝臟的病理評(píng)分，但是利用HAI對(duì)DON引起的肝臟病理評(píng)分來看，并沒有發(fā)現(xiàn)DON對(duì)肝臟組織損傷的影響。是評(píng)分系統(tǒng)需要修改，還是豬肝組織對(duì)單獨(dú)的DON并不敏感，需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

表2 修改后分期：結(jié)構(gòu)改變，纖維化，肝硬化

有部分研究者對(duì)HAI進(jìn)行了大量修改，甚至建立了自己的DON肝損傷評(píng)價(jià)體系。應(yīng)用肝臟病理評(píng)分來評(píng)價(jià)分析DON對(duì)仔豬肝臟的損傷，依據(jù)空泡化、小葉間和匯管區(qū)纖維化、膽管增生、局部性髓性血細(xì)胞等進(jìn)行評(píng)價(jià)，也沒有發(fā)現(xiàn)DON對(duì)肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響[39]。但是，Grenier等[40]建立了肝損傷的評(píng)分體系表3所示，研究5周齡去勢(shì)雄性小豬飼喂DON(2.8 mg/kg)5周，從肝損傷的嚴(yán)重性和密度進(jìn)行病理學(xué)評(píng)分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DON嚴(yán)重提高肝臟的病理?yè)p傷評(píng)分。5周齡去勢(shì)公豬飼喂DON(98 mg/kg)的飼料,飼喂35 d，利用肝臟病理學(xué)評(píng)分，發(fā)現(xiàn)DON增加了肝臟病理評(píng)分[41]。Gerez等[42]建立了肝損傷評(píng)分，如表4所示，評(píng)價(jià)5周齡去勢(shì)公豬飼喂28 d 含DON(1.5 mg/kg)的飼料，檢查豬的肝臟損傷，發(fā)現(xiàn)DON處理顯著增加肝臟病理評(píng)分。5周齡斷奶雄性去勢(shì)仔豬，按體重1 nmol/kg DON 飼喂14 d，然后換0.5 nmol/kg DON飼喂21 d，試驗(yàn)結(jié)束采用Grenier等[43]建立的真菌毒素引起豬肝臟損傷的病理學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(如表5所示)[44]，依據(jù)表5進(jìn)行病理評(píng)估，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DON顯著提高肝臟的組織損傷程度。近來隨著肝臟病理半定量評(píng)分系統(tǒng)建并發(fā)展，較多研究發(fā)現(xiàn)DON顯著增加豬肝臟的病理?yè)p傷評(píng)分。完善肝臟的半定量病理評(píng)分可能增加了DON對(duì)豬肝臟損傷的統(tǒng)計(jì)率。

表3 建立肝損傷評(píng)分點(diǎn)評(píng)價(jià)組織損傷

表4 建立一個(gè)損傷評(píng)分點(diǎn)評(píng)價(jià)豬組織損傷

表5 建立一個(gè)損傷評(píng)分點(diǎn)用來評(píng)價(jià)肝臟組織損傷

小結(jié)

綜上所述，肝臟是DON毒性作用的主要靶器官，盡管研究的結(jié)果不太一致，可能與DON暴露的不同生理階段，時(shí)間長(zhǎng)短，劑量，研究者采用的不同研究方法(例如電鏡對(duì)亞細(xì)胞結(jié)果的觀察可能更加敏感)，也跟研究者所采用不同的半定量肝損傷評(píng)分體系，或者只是進(jìn)行病理組織觀察有關(guān)。DON對(duì)肝臟的長(zhǎng)期，低劑量，尤其是敏感的生理階段例如妊娠期，新生期或者哺乳期是否引起組織細(xì)胞的病理學(xué)變化有待進(jìn)一步探討。妊娠期、新生期和哺乳期，這些敏感階段(稱窗口期)機(jī)體在應(yīng)對(duì)持續(xù)性炎癥反應(yīng)可能程序化的引起器官組織細(xì)胞形態(tài)的改變，從而影響后代的生長(zhǎng)、健康等。近年來的病理評(píng)分體系，較之前有較大的改善，但可能仍需進(jìn)一步的實(shí)踐研究及優(yōu)化，損傷的嚴(yán)重性級(jí)別是否更高，在壞死階段，局灶性溶解性壞死是否更嚴(yán)重，也有待考慮。DON導(dǎo)致的肝損傷常表現(xiàn)為纖維化，在修改后的HAI評(píng)分中是分期就是炎癥損傷的階段，并沒有在新建評(píng)分體系中體現(xiàn)，可能需要進(jìn)一步優(yōu)化。本文全面系統(tǒng)的總結(jié)肝臟的組織學(xué)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和DON對(duì)肝臟的病理影響及半定量評(píng)分，為DON引起肝臟損傷的病理研究提供參考。