楊亞軍，何金科，宋勝男，楊寧寧，陳創(chuàng)夫,3*，王震,3*

(1. 石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,新疆 石河子 832000;2. 石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,新疆 石河子 832000；3. 石河子大學(xué)西部地區(qū)高發(fā)人獸共患傳染性疾病防治協(xié)同創(chuàng)新中心，新疆 石河子 832000)

妊娠相關(guān)糖蛋白(PAGs)是反芻動(dòng)物滋養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生的一大類(lèi)分泌型蛋白[1]。PAGs形成了一個(gè)大的糖蛋白多態(tài)性家族，在牛滋養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)了超過(guò)20個(gè)PAG(BoPAGs)成員。第一個(gè)分離牛胎盤(pán)的BoPAG稱BoPAG1,因蛋白分子量是 67 kD，所以又稱BoPAG 67 kD[2]。PAGs屬于脊椎動(dòng)物天冬氨酸蛋白酶家族，因此它們與胃蛋白酶、凝乳酶、組織蛋白酶D或腎素等多種酶直接相關(guān)[3]。基于這一關(guān)系，許多研究分析了一些PAGs中的蛋白水解酶活性[4-6]。它們被懷疑在胎盤(pán)-子宮界面潛在生長(zhǎng)因子的生化處理中起作用[7]。另一方面，由于催化位點(diǎn)周?chē)陌被嶂脫Q，所以牛PAGs沒(méi)有酶活性[8-9]。但PAGs仍被認(rèn)為具有免疫調(diào)節(jié)和黃體生成作用[10]。盡管PAG被稱為與懷孕相關(guān)，但是PAG在維持妊娠和發(fā)揮的具體功能目前尚不清楚[11]。根據(jù)序列的系統(tǒng)發(fā)育分析，PAG可以分為兩類(lèi)：“古代” PAG和“現(xiàn)代” PAG[12]?！艾F(xiàn)代”P(pán)AG的表達(dá)通常僅限于雙核滋養(yǎng)細(xì)胞(BNC)，而古代PAG主要在單核滋養(yǎng)細(xì)胞(UNC)中表達(dá)[1]。BoPAG7屬于“現(xiàn)代”，而B(niǎo)oPAG8屬于“古代”?，F(xiàn)代PAGs組的成員可以用作牛血或牛奶中的生化妊娠標(biāo)記[13]。PAGs著床后立即在懷孕初期分泌出來(lái)，在牛受精的第19天，進(jìn)入母體循環(huán)并作為懷孕檢測(cè)的特定標(biāo)記[14]。它們被認(rèn)為是用于懷孕檢測(cè)的首選分子，因?yàn)樗鼈冊(cè)谠u(píng)估胎兒的生存能力和早期胚胎死亡率方面具有其他用途。母體血液中PAGs的水平下降，并在早期胚胎死亡期間逐漸消失，因此成為胚胎存活的獨(dú)特生物標(biāo)記[15]。研究表明，BoPAG7在妊娠早期在胎盤(pán)組織中比其他妊娠相關(guān)糖蛋白更豐富[11]。通過(guò)實(shí)施定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，妊娠早期胎盤(pán)組織中BoPAG8有較高轉(zhuǎn)錄水平[16]，表明BoPAG7和BoPAG8蛋白在妊娠期發(fā)揮著重要的作用。本試驗(yàn)旨在采取原核表達(dá)的方法制備荷斯坦奶牛BoPAG7和BoPAG8蛋白，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為該種蛋白的結(jié)構(gòu)功能提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

限制性內(nèi)切酶HindⅢ、BamHⅠ、XhoⅠ，2×TaqMaster Mix，30% Acrylamide，Tris-HCl，SDS，超純RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒等。

1.2 生物信息學(xué)分析

通過(guò)SignalP 4.1 Server在線軟件預(yù)測(cè)蛋白信號(hào)肽，通過(guò)TMHMM Server v.2.0 在線軟件分別預(yù)測(cè)蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)，通過(guò)NetNGIyc 1.0 Server在線軟件對(duì)蛋白進(jìn)行糖基化修飾位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，通過(guò)SOPMA在線軟件預(yù)測(cè)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，通過(guò)phyre2在線軟件分別預(yù)測(cè)蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)，通過(guò)IEDB在線軟件預(yù)測(cè)分析蛋白質(zhì)線性B細(xì)胞抗原表位，通過(guò)STRING在線軟件預(yù)測(cè)不同蛋白之間的相互作用

1.3 目的基因的獲取

登陸NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)分別查找BoPAG7(登錄號(hào)：BC133469.1)和BoPAG8(登錄號(hào)：NM_176619.3)的DNA序列，通過(guò)引物設(shè)計(jì)軟件Primer5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物前面兩個(gè)斜體的核苷酸為保護(hù)性堿基、下劃線部分為引物的酶切位點(diǎn)，引物序列詳見(jiàn)表1。通過(guò)超純RNA提取試劑盒提取胎盤(pán)組織RNA，并通過(guò)反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA為模版，PCR擴(kuò)增BoPAG7和BoPAG8基因，PCR反應(yīng)體系為：12.5 μL Taq Master Mix(2×)，上下游引物(10 μmol/L)各0.4/μL，cDNA 2/μL，加ddH20至25/μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 預(yù)變性5 min，94 ℃ 變性40 s，退火30 s，72 ℃延伸75 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min，PCR擴(kuò)增的目的基因與pMDTM19-T克隆載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，通過(guò)菌液PCR驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果正確后測(cè)序。

表1 目的基因擴(kuò)增所需引物

1.4 表達(dá)載體和表達(dá)菌株的構(gòu)建

將測(cè)序準(zhǔn)確的目的基因與表達(dá)載體分別用pET-28a和pET-30a雙酶切后鏈接，將鏈接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α大腸桿菌中，通過(guò)菌液PCR驗(yàn)證后通過(guò)雙酶切驗(yàn)證，雙酶切反應(yīng)體系為：質(zhì)粒10 μL，10×QuickCut Buffer 2 μL，上下游酶如表1所示，各1 μL，加ddH2O至20 μL，將鑒定成功后的BoPAG7-30a和BoPAG8-28a重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)內(nèi)，再次經(jīng)過(guò)菌液PCR驗(yàn)證成功后，進(jìn)行蛋白的原核表達(dá)及純化。

1.5 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

取BoPAG7-30a和BoPAG8-28a表達(dá)菌株接種至LB 液體培養(yǎng)基中，置于搖床(37 ℃、230 r/min)震蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD600約為0.4～0.6)，加入異丙基硫代乳苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)，分別取TPTG誘導(dǎo)0、2、4、6、8 h后的菌液各1 mL，8 000 r/min離心5 min收集菌體，加入80 μL去離子水重懸菌體和20 μL蛋白上樣緩沖液(5×SDS-PAGE Loding Buffer)，震蕩混勻后金屬浴100 ℃作用10 min，經(jīng)12% 十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后對(duì)凝膠進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染液染色、脫色并觀察結(jié)果。

1.6 Western Blot檢測(cè)

通過(guò)半干式轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)將SDS-PAGE凝膠上的蛋白樣品用轉(zhuǎn)移至NC膜上，使用脫脂奶粉封閉NC膜。洗滌緩沖液(tris buffered saline tween，TBST)洗滌3次，加入Anti His-Tag Mouse Monoclonal Antibody作為一抗，37 ℃ 作用1 h。使用TBST洗滌3次。加入二抗山羊抗鼠IgG-HRP，37 ℃ 作用1 h；TBST洗滌緩沖液洗滌3次。加顯色液顯色。

2 結(jié)果

2.1 BoPAG7和BoPAG8蛋白的生物信息學(xué)分析

通過(guò)SignalP 4.1 Server預(yù)測(cè)蛋白信號(hào)肽如圖1所示，BoPAG7和BoPAG8 N端前15個(gè)氨基酸序列為信號(hào)肽，通過(guò)TMHMM Server v.2.0在線軟件，分別預(yù)測(cè)并分析蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，2個(gè)蛋白都無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域(圖2)。故該2種蛋白都為可分泌型蛋白。

圖1 蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)

圖2 蛋白跨膜區(qū)預(yù)測(cè)

通過(guò)NetNGIyc 1.0 Server在線軟件對(duì)蛋白進(jìn)行糖基化修飾位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，2個(gè)蛋白均發(fā)生糖基化修飾，其中BoPAG7在Asp57、Asp74、Asp103、Asp125、Asp1825個(gè)位點(diǎn)發(fā)生N連接糖基化修飾，BoPAG8在Asp218位點(diǎn)處發(fā)生N連接糖基化修飾，結(jié)果如圖3所示。

圖3 蛋白糖基化預(yù)測(cè)

通過(guò)SOPMA在線軟件預(yù)測(cè)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖4所示。所有蛋白主要以α-螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲和延伸鏈組成，所占比例如表2所示。通過(guò)phyre2在線軟件分別預(yù)測(cè)2個(gè)蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，為蛋白的可視化分析提供理論基礎(chǔ)。

圖4 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

表2 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)所占比例

使用IEDB在線軟件預(yù)測(cè)分析蛋白質(zhì)線性B細(xì)胞抗原表位，結(jié)果如圖6。分析結(jié)果顯示，BoPAG7和BoPAG8蛋白具有豐富的抗原表位，抗原表位序列見(jiàn)表3和表4所示。

圖5 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

圖6 2種蛋白B細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)

表3 BoPAG7線性B細(xì)胞抗原表位多肽

表4 BoPAG8線性B細(xì)胞抗原表位多肽

通過(guò)STRING在線軟件預(yù)測(cè)BoPAG7和BoPAG8蛋白的相互作用，結(jié)果如圖7和表5所示。與BoPAG7互作的蛋白包括THSD4、PRP1、PRSS37和CAPZA3，與BoPAG8互作的蛋白為PRP3和BCL7A。

表5 BoPAG7和BoPAG8蛋白相互作用的功能蛋白、途徑和蛋白結(jié)構(gòu)域

圖7 BoPAG7和BoPAG8的蛋白質(zhì)相互作用

2.2 目的基因的克隆

PCR擴(kuò)增BoPAG7和BoPAG8基因，大小分別為1 098 bp和1 119 bp(圖8)，經(jīng)PCR和雙酶切鑒定的陽(yáng)性菌送公司測(cè)序。結(jié)果表明，擴(kuò)增出的BoPAG7和BoPAG8基因與GenBank上發(fā)表的堿基序列同源性一致。

M. DNA Marker； A 1～4. BoPAG7基因；B 1～4. BoPAG8基因圖8 基因PCR擴(kuò)增

2.3 表達(dá)載體雙酶切驗(yàn)證

將表達(dá)載體BoPAG7-30a和BoPAG8-28a通過(guò)雙酶切，結(jié)果如圖9所示，酶切下的基因片段大小與理論值大小相符，表明已成功構(gòu)建原核表達(dá)載體。

M. DNA Marker； A 1. 陰性對(duì)照；2、3. BoPAG7-30a雙酶切；B 1. 陰性對(duì)照；B 2、3. BoPAG8-28a雙酶切圖9 表達(dá)載體雙酶切驗(yàn)證

2.4 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

將成功構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入到表達(dá)菌株DE3(BL21)感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)0、2、4、6、8 h后，將表達(dá)菌液經(jīng)12%的SDS-PAGE分析，分別得到大小約為45 kD的BoPAG7蛋白和約46 kD的BoPAG8蛋白，與預(yù)期蛋白分子量大小一致。并通過(guò)鎳柱親和層析法純化得到較純的目的蛋白，結(jié)果如圖10所示。

M.蛋白Marker；A 1. BoPAG7-30a; B 1.BoPAG8-28a DE3空載體；A、B 2～6. 0、2、4、6、8 h誘導(dǎo)菌體；C 1、2. BoPAG7-30a；D 1、2.BoPAG8-28a蛋白純化圖10 蛋白誘導(dǎo)表達(dá)與純化

2.5 純化蛋白的驗(yàn)證

通過(guò) Western blot 分析，對(duì)純化蛋白進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，BoPAG7蛋白在約45 kD處、BoPAG8蛋白在約46 kD處均有明顯的條帶，與理論分析值相符(圖11)。

M.蛋白Marker；A.BoPAG7蛋白、B.BoPAG8蛋白圖11 蛋白純化后Western blot分析

3 討論

PAGs又稱為妊娠特異性蛋白B(PSPB)，是一個(gè)大家族的糖蛋白，在反芻動(dòng)物胎盤(pán)上皮細(xì)胞層(絨毛膜/滋養(yǎng)外胚層)特異表達(dá)[17]。PAG蛋白的確切功能可能主要體現(xiàn)在胎盤(pán)發(fā)生、胚胎保護(hù)、母體排斥反應(yīng)、母體識(shí)別和妊娠維持等方面[18]。本研究預(yù)測(cè)分析了BoPAG7和BoPAG8蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)，2個(gè)蛋白主要以無(wú)規(guī)卷曲和延伸鏈為主，對(duì)BoPAG7和BoPAG8蛋白進(jìn)行蛋白互作分析，結(jié)果顯示，與BoPAG7互作的蛋白有4個(gè)，與BoPAG8互作的蛋白有2個(gè)，其中BoPAG7和BoPAG8與催乳素相關(guān)蛋白(PRPs)有互作作用，催乳素相關(guān)蛋白是牛的非經(jīng)典催乳素(PRL)生長(zhǎng)激素家族的成員，但是，其功能仍然未知[19]。PRP蛋白在妊娠20 d后可在胎盤(pán)滋養(yǎng)層雙核細(xì)胞中檢測(cè)到，據(jù)報(bào)道bPRP1可能是滋養(yǎng)細(xì)胞分化的優(yōu)良標(biāo)志物，也是妊娠診斷的候選者[20]。預(yù)測(cè)到BoPAG8可與BCL7A相互作用，BCL7A缺乏會(huì)改變了小腦浦肯野樹(shù)突細(xì)胞的高度分枝，并損害了運(yùn)動(dòng)技能，然而B(niǎo)CL7A的普遍缺失會(huì)導(dǎo)致圍產(chǎn)期致死[21]。絲氨酸蛋白酶在消化、凝血、凋亡和免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用，其中，PRSS37是在塑形期精子中出現(xiàn)而在成熟精子中消失的一種功能未知的絲氨酸蛋白酶[22]。但BoPAG7和BoPAG8的具體的生物學(xué)功能仍需深入研究。滋養(yǎng)層雙核細(xì)胞(BNCS)在胞質(zhì)顆粒中儲(chǔ)存多種糖蛋白，并具有特定的糖基化模式[17]。糖基化確實(shí)在PAGs的抗原性中起作用，并且在懷孕期間也可能起作用[23]。本研究成功預(yù)測(cè)到BoPAG7有5個(gè)位點(diǎn)發(fā)生N連接糖基化修飾，分別是Asp57、Asp74、Asp103、Asp125和Asp182，BoPAG8在Asp218位點(diǎn)處發(fā)生N連接糖基化修飾。信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析顯示，BoPAG7和BoPAG8 N端前15個(gè)氨基酸序列為信號(hào)肽，且無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)，表明這該蛋白為可分泌型蛋白。對(duì)BoPAG7和BoPAG8蛋白進(jìn)行B細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)分析，結(jié)果顯示，BoPAG2含有多個(gè)線性表位，這表明其作為抗原能引起良好的免疫應(yīng)答。

綜上，本研究通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析，預(yù)測(cè)到BoPAG7和BoPAG8蛋白分別有5個(gè)和1個(gè)N鏈接糖基化，同時(shí)對(duì)其蛋白的結(jié)構(gòu)和B細(xì)胞抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，并且對(duì)不同蛋白間互作進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。通過(guò)原核表達(dá)并純化獲得了BoPAG7和BoPAG8蛋白，為BoPAG7和BoPAG8蛋白抗體的制備和功能的研究提供了基礎(chǔ)。