楊碩，盧洋洋，韋玥瑞，史彬林，娜仁花

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

內(nèi)蒙古地區(qū)具有豐富的家畜與草場資源，草地畜牧業(yè)是該地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)支柱，也是我國主要的綠色有機(jī)畜牧產(chǎn)品生產(chǎn)基地。2016年內(nèi)蒙地區(qū)羊出欄量為5 971.3萬只,產(chǎn)絨量為8 498.23 t，分別占全國的19.45%和45.10%[1]。大青山絨山羊作為正在培育的一個(gè)肉絨兼用新品種，具有較穩(wěn)定的遺傳性能和較高的生產(chǎn)性能，在內(nèi)蒙古地區(qū)具有不可替代的養(yǎng)殖地位以及經(jīng)濟(jì)價(jià)值。大青山絨山羊常年以自然放牧為主，然而受冬季寒冷因素影響，該地區(qū)牧草枯黃期長，導(dǎo)致放牧條件下絨山羊營養(yǎng)攝入不足，嚴(yán)重影響其產(chǎn)肉和產(chǎn)絨的生產(chǎn)性能。相關(guān)研究表明，冬季補(bǔ)飼精料可顯著提高歐拉型藏羊日增重，增強(qiáng)過冬度春的能力[2]；而且，補(bǔ)飼精料后肉品質(zhì)及屠宰性能均顯著提高[3-4]。因此，在枯草期進(jìn)行放牧與補(bǔ)飼合理結(jié)合，是實(shí)現(xiàn)放牧絨山羊營養(yǎng)均衡的主要措施。但是，日糧類型的改變勢必會(huì)對瘤胃微生物區(qū)系產(chǎn)生重要影響。補(bǔ)飼可顯著提高放牧羊瘤胃微生物多樣性，且瘤胃微生物數(shù)量也隨著補(bǔ)飼精料后發(fā)生顯著性變化[5-6]。本研究利用高通量測序技術(shù)研究放牧大青山絨山羊瘤胃微生物的多樣性以及補(bǔ)飼對瘤胃微生物多樣性帶來的影響。為研究大青山絨山羊瘤胃微生物(細(xì)菌、甲烷菌)多樣性提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間與試驗(yàn)地點(diǎn)

試驗(yàn)于2016年11月中旬至12月中下旬，在內(nèi)蒙古呼和浩特市土左旗大青山種羊場進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與樣品采集

試驗(yàn)選用年齡1歲、體重(38.2±1.6)kg的大青山絨山羊(羯羊)10只，經(jīng)檢疫和驅(qū)蟲后，飼養(yǎng)觀察7 d。試驗(yàn)分放牧組(natural grazing, NG)和補(bǔ)飼組(grazing with supplementary feeding, GS)，每組5只。自然放牧組每天10:00至17:00期間在天然草場進(jìn)行放牧，補(bǔ)飼組在自然放牧的基礎(chǔ)上每天18:00補(bǔ)飼精料1次，每只補(bǔ)飼0.5 kg。整個(gè)試驗(yàn)期分為預(yù)飼期22 d和試驗(yàn)期7 d，共29 d。羊舍環(huán)境及飼養(yǎng)管理保持一致。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)禁食12 h后，將瘤胃液樣品采集器經(jīng)羊的口腔、食道插入瘤胃內(nèi)，進(jìn)行體外采集瘤胃液，經(jīng)4層紗布過濾后，迅速投入液氮保存以備DNA提取。

1.3 日糧和牧草營養(yǎng)成分組成

采用劃區(qū)分點(diǎn)采樣方法，采集地面可食用部分的牧草，經(jīng)粉碎混勻后，采用四分法獲得分析樣品。補(bǔ)飼的精料購自呼和浩特市新凱飼料廠。主要采食的牧草營養(yǎng)組分及補(bǔ)飼精料營養(yǎng)組分見表1。

表1 絨山羊主要采食牧草的營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ)) %

1.4 瘤胃微生物DNA提取

參照文獻(xiàn)[7]提供的珠磨—十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法，提取瘤胃液中總DNA，經(jīng)酶標(biāo)儀和瓊脂糖凝膠電泳測定每個(gè)樣品DNA濃度及條帶完整性，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 熒光定量PCR擴(kuò)增與Illumina HiSeq測序

以瘤胃微生物總DNA為模板，對16S rDNA V3至V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，建立DNA文庫，所用細(xì)菌、甲烷菌的通用引物分別為515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)； 1106F (F:5′-TTWAGTCAGGCAACGAGC-3′)和1378R (R:5′-TGTGCAAGGAGCAGGGAC-3′)。PCR反應(yīng)體系：2.5 μL引物(上游引物、下游引物各1.25 μL)，12.5 μL 2×Phusion Master Mix，2 μL模板DNA，和8.0 μL ddH2O。反應(yīng)參數(shù)：98 ℃預(yù)變性30 s；98 ℃變性10 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣，充分混勻后使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，對目的條帶使用qiagen公司提供的膠回收試劑盒回收產(chǎn)物。使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit和qPCR定量，文庫合格后，使用HiSeq 2500 PE250進(jìn)行上機(jī)測序。

1.6 數(shù)據(jù)處理與生物信息學(xué)分析

利用Uparse 軟件對所有樣品的全部 Effective Tags進(jìn)行聚類，以97%的一致性(Identity)，將序列聚類，使之成為可執(zhí)行分類操作單位(Operational Taxonomic Units，OTUs)。用Mothur方法與SILVA的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋分析(設(shè)定閾值為0.8～1)，獲得分類學(xué)信息，并分別在各個(gè)分類水平上，使用Qiime軟件(Version 1.7.0)計(jì)算Chao1、Shannon，使用R軟件進(jìn)行Alpha多樣性指數(shù)組間差異分析。通過將觀察到的OTUs數(shù)量除以估計(jì)的最大OTUs數(shù)量來計(jì)算當(dāng)前的百分比覆蓋率。經(jīng)Excel 2007對放牧組和補(bǔ)飼組樣品菌群的相對豐富度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，然后采用SAS 9.2統(tǒng)計(jì)軟件并進(jìn)行T檢驗(yàn)，以P<0.05作為差異性顯著性判定標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 補(bǔ)飼對放牧條件下大青山絨山羊瘤胃液細(xì)菌多樣性的影響

經(jīng)Illumina HiSeq高通量測序和數(shù)據(jù)質(zhì)量控制，除去接頭序列、低復(fù)雜序列和低質(zhì)量序列后， 兩組細(xì)菌和產(chǎn)甲烷菌OTUs數(shù)以及α多樣性見表2。在細(xì)菌種水平上，補(bǔ)飼組中Shannon指數(shù)低于放牧組，差異極顯著(P<0.01)，其他OTUs數(shù)量和Chaol指數(shù)均無顯著差異性(P>0.05)；在甲烷菌種水平上，補(bǔ)飼精料組OTUs數(shù)、Chaol指數(shù)顯著高于放牧組(P<0.05)，Shannon指數(shù)差異不顯著(P>0.05)。

表2 補(bǔ)飼對放牧條件下大青山絨山羊瘤胃液中微生物多樣性的影響

2.2 補(bǔ)飼對放牧條件下大青山絨山羊瘤胃微生物相似性比較分析

對放牧組與補(bǔ)飼組瘤胃微生物在門水平上的相似性利用非加權(quán)配對算術(shù)平均法(UPGMA)進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖1所示。放牧組大青山絨山羊瘤胃微生物能清晰的與補(bǔ)飼組相區(qū)分，即在細(xì)菌門水平上(圖1A)各放牧組間相似性較高，聚在一起；各補(bǔ)飼組間相似性較高，聚集在一起形成另一簇。同樣，在產(chǎn)甲烷菌門水平上(圖1B)放牧組與補(bǔ)飼組形成2大簇。該結(jié)果說明由補(bǔ)飼引起的日糧品質(zhì)的改變，對瘤胃內(nèi)微生物豐度產(chǎn)生了一定的影響。

注：NG，放牧組;GS，補(bǔ)飼組圖1 瘤胃微生物門水平上相似性聚類分析

2.3 補(bǔ)飼對放牧條件下大青山絨山羊瘤胃液中細(xì)菌多樣性的影響

補(bǔ)飼對放牧條件下大青山絨山羊瘤胃液中細(xì)菌多樣性的影響見表3。大青山絨山羊瘤胃液中細(xì)菌在門水平上主要是擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)。與對照組相比，補(bǔ)飼組擬桿菌門細(xì)菌豐度極顯著高于放牧組(P<0.01)，而且變形菌門細(xì)菌豐度也顯著升高(P<0.05)，但厚壁菌門細(xì)菌豐度顯著低于放牧組(P<0.05)；放牧組中的互養(yǎng)菌門(Synergistetes)細(xì)菌豐度顯著高于補(bǔ)飼組(P<0.05)；補(bǔ)飼對其他菌門無顯著性影響(P>0.05)。

表3 補(bǔ)飼對放牧條件下大青山絨山羊瘤胃細(xì)菌菌群豐度的影響(門、科水平)

選取每個(gè)樣品在科水平上最大豐度排名前6的物種，分別為普雷沃氏菌科(Prevotellaceae) 、韋榮球菌科(Veillonellaceae)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)、理研菌科(Rikenellaceae)和互養(yǎng)菌科(Synergistaceae)。補(bǔ)飼精料組顯著增加了瘤胃液中普雷沃氏菌科細(xì)菌豐度(P<0.01)，但顯著降低于韋榮球菌科、瘤胃球菌科、理研菌科以及互養(yǎng)菌科細(xì)菌豐度(P<0.05)。其他菌科間并無顯著性差異(P>0.05)。

2.4 補(bǔ)飼對放牧條件下大青山絨山羊瘤胃液中產(chǎn)甲烷菌多樣性的影響

補(bǔ)飼對放牧條件下大青山絨山羊瘤胃液中產(chǎn)甲烷菌區(qū)系在科水平上組成的影響見表4。可鑒定到科水平的大青山絨山羊瘤胃產(chǎn)甲烷菌主要為甲烷桿菌科、甲烷八疊球菌科、甲烷微菌科。補(bǔ)飼組瘤胃液中甲烷桿菌科顯著高于放牧組(P<0.05)，而甲烷八疊球菌科和甲烷微菌科顯著低于放牧組(P<0.05)。另外，放牧組與補(bǔ)飼組瘤胃液中未鑒定的甲烷菌科分別占41.14%、39.33%。

大青山絨山羊瘤胃產(chǎn)甲烷菌在屬水平上的差異見表4。甲烷短桿菌屬為絕對優(yōu)勢菌屬，且補(bǔ)飼組顯著高于放牧組(P<0.05)，分別占總產(chǎn)甲烷菌屬的59.97%、47.76%。放牧組中的甲烷微球菌屬顯著高于放牧組(P<0.05)，而甲烷球形菌屬低于補(bǔ)飼組，差異趨于顯著(P=0.06)。另外，將不屬于任何已知屬的甲烷菌標(biāo)注為未分類甲烷菌，分別占放牧組和補(bǔ)飼組的45.97%、39.53%。

表4 補(bǔ)飼對放牧條件下大青山絨山羊瘤胃產(chǎn)甲烷菌菌群豐度的影響(科、屬水平)

3 討論

3.1 補(bǔ)飼對放牧條件下大青山絨山羊瘤胃液中細(xì)菌多樣性的影響

分析瘤胃液樣品的OTUs數(shù)量和α多樣性，其結(jié)果可以反映微生物群落的豐度和多樣性。本研究通過HiSeq測序發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)飼精料組大青山絨山羊瘤胃液細(xì)菌OTUs數(shù)量低于放牧組，分別為1 357、1 289。表明不同飼養(yǎng)條件下大青山絨山羊瘤胃微生物種類均很豐富。但本試驗(yàn)的OTUs數(shù)量低于陳蕓等[8]對黑山羊的研究結(jié)果。這可能由于不同宿主動(dòng)物進(jìn)化歷程的差異性所致，同時(shí)與絨山羊的生存環(huán)境、所處地理位置、草場類型不同也存在關(guān)系。另外，補(bǔ)飼組的特征指數(shù)Chao1、ACE、Shannon均低于放牧組，表明在補(bǔ)飼精料的過程中，粗蛋白、淀粉等含量的增加對瘤胃微生物結(jié)構(gòu)有重要影響。

瘤胃細(xì)菌是瘤胃中最多樣化的群體，能夠利用纖維、淀粉、蛋白質(zhì)和糖，在動(dòng)物健康和生產(chǎn)性能中具有重要作用[9]。本研究對絨山羊瘤胃細(xì)菌群落分析顯示，瘤胃擬桿菌門和厚壁菌門為主要的優(yōu)勢菌，其他菌門豐度相對較少，這與過去對反芻動(dòng)物的許多研究一致[10]。在門水平上，與放牧組相比補(bǔ)飼精料使擬桿菌門增加了19.61%，然而厚壁菌門豐度降低了18.03%。曾燕[11]報(bào)道與本試驗(yàn)中絨山羊不同，認(rèn)為綿羊瘤胃內(nèi)相對豐度最高的為厚壁菌門(44.37%)，蒙古羊瘤胃相對豐度最高的為擬桿菌門(67%)。韓旭峰等[12]研究發(fā)現(xiàn)，80～110日齡陜北絨山羊瘤胃微生物以厚壁菌門為主。以上結(jié)果表明，瘤胃細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)受反芻動(dòng)物品種、日齡等因素的影響，其群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。另外，補(bǔ)飼精料后變形菌門豐度顯著增加，林波等[13]在對水牛瘤胃微生物的研究中也有相似發(fā)現(xiàn)。有研究發(fā)現(xiàn)，初生(1～3 d)犢牛和乳汁補(bǔ)充日糧飼養(yǎng)的2月齡犢牛瘤胃中變形菌門的豐度最高，6月齡后奶牛瘤胃中變形菌門的豐度急劇下降[14]。這一結(jié)果可能是因?yàn)闋倥Ｔ跀嗄毯髷z入飼糧中蛋白含量降低，纖維含量升高引起的。在本試驗(yàn)中，放牧組牧草蛋白含量較低，中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量較高，而補(bǔ)飼的精料中具有較高的蛋白含量以及較低的纖維含量，因此推測變形菌門的豐度隨纖維含量的增加而減少，并且與日糧中的蛋白含量呈正相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，變形菌門主要包括的屬為假單胞菌，多數(shù)假單胞菌能夠產(chǎn)生角蛋白酶，該酶具有很強(qiáng)的蛋白質(zhì)降解功能[15]。該觀點(diǎn)可為上述假設(shè)提供一定的輔助性參考。本試驗(yàn)進(jìn)一步在科水平上的研究發(fā)現(xiàn)，擬桿菌門中的普雷沃氏菌科，厚壁菌門中的韋榮球菌科、毛螺菌科、瘤胃球菌科與上述變化具有相同的趨勢。這些豐度的差異，可能是因日糧中纖維含量的不同造成的[16]。普雷沃氏菌科在兩組中為優(yōu)勢菌，且補(bǔ)飼精料后顯著增加了豐度。與前人研究結(jié)果對比分析發(fā)現(xiàn)，普雷沃氏菌的豐度并不總是隨著日糧的變化而表現(xiàn)出規(guī)律性變化。有人發(fā)現(xiàn)飼喂干草組山羊瘤胃中的普雷沃氏菌豐度高于精料組[17]。然而，也有人認(rèn)為，雖然不同日糧組綿羊瘤胃中普雷沃氏菌的豐度差異不顯著，但與粗糧組相比，精料組中普雷沃氏菌呈上升趨勢[18]。這一結(jié)果與本試驗(yàn)的研究結(jié)果具有相似性。普氏菌中有許多種類，它們參與半纖維素、果膠、淀粉和蛋白質(zhì)的降解[19]。由于普雷沃氏菌的種類和對底物的偏好不同，日糧結(jié)構(gòu)的變化并不一定會(huì)引起普雷沃氏菌豐度的規(guī)律性變化。瘤胃球菌由白色瘤胃球菌和黃色瘤胃球菌兩種強(qiáng)纖維消化細(xì)菌組成，可產(chǎn)生大量的纖維素酶和半纖維素酶。受底物誘導(dǎo)的影響，纖維含量越高，瘤胃球菌的豐度越高[20]。據(jù)報(bào)道，瘤胃毛螺菌在消化纖維過程中與產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌具有協(xié)同作用[21]。然而，由于分離培養(yǎng)困難，對毛螺菌的生理特性理解不夠深入[22]，其在纖維消化中的作用有待進(jìn)一步研究。

3.2 補(bǔ)飼對放牧條件下大青山絨山羊瘤胃液中產(chǎn)甲烷菌多樣性的影響

產(chǎn)甲烷菌廣泛存在于反芻動(dòng)物胃腸道中，在維持瘤胃代謝及功能方面發(fā)揮著重要作用[23]。有人提出，瘤胃產(chǎn)甲烷菌的特定性可能與宿主飼料轉(zhuǎn)化效率有關(guān)；然而，由于可用于發(fā)酵的食物變化，日糧化學(xué)組成極大地影響瘤胃中甲烷的生成[24]。因此，本試驗(yàn)試圖通過高通量測序技術(shù)，對比放牧與補(bǔ)飼條件下大青山絨山羊瘤胃產(chǎn)甲烷菌的群落結(jié)構(gòu)。

在瘤胃中，古菌占所有微生物的4%[25]。本研究也發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)甲烷菌α多樣性指數(shù)遠(yuǎn)小于細(xì)菌，但隨補(bǔ)飼精料后產(chǎn)甲烷菌豐度發(fā)生改變，特別補(bǔ)飼組中的OTUs數(shù)量以及Chao1指數(shù)顯著高于放牧組。產(chǎn)甲烷菌作為專性厭氧古菌，不能直接利用復(fù)雜有機(jī)物，只能利用瘤胃細(xì)菌、原蟲和真菌的發(fā)酵產(chǎn)物(H2、CO2、甲酸鹽等)作為能量來源，所以，受飼養(yǎng)環(huán)境、飼料組成及飼喂方式等因素影響較大。本試驗(yàn)在產(chǎn)甲烷菌科水平上研究表明，大青山絨山羊瘤胃內(nèi)產(chǎn)甲烷菌以甲烷桿菌科為主。這與國內(nèi)外報(bào)道在其他反芻動(dòng)物上的研究結(jié)果一致[26-27]。補(bǔ)飼精料后甲烷桿菌顯著提高，通過屬水平分析可知，甲烷短桿菌屬、甲烷球形菌屬、甲烷桿菌屬是甲烷桿菌的主要成員，它們能夠利用H2還原甲醇。在瘤胃中，甲醇是原蟲水解果膠和細(xì)菌酯酶活性的產(chǎn)物。牧草是一種相對較差的日糧果膠來源，而精料中一些成分，如柑橘和甜菜果肉中含有豐富的果膠。有人研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)飲食中的精料部分增加時(shí)，原蟲數(shù)量會(huì)增加， 造成瘤胃內(nèi)可用甲醇量增加[28]。因此，補(bǔ)飼精料可能是通過甲醇含量的變化造成甲烷桿菌豐度的升高。已有報(bào)道稱，豐度較低的微生物在不同環(huán)境中發(fā)揮重要作用，即使這些基因型僅占所有基因型的3%，依然在代謝效率方面起到重要調(diào)節(jié)作用，最終導(dǎo)致寄主飼料利用率和宿主甲烷排放的變化[29]。雖然本研究中放牧組甲烷微球菌屬豐度較低，但有可能是產(chǎn)生甲烷的主要菌群，補(bǔ)飼顯著降低了其豐度，從而引起瘤胃甲烷生成的減少。利用qPCR對16S rRNA基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)甲烷的產(chǎn)量主要?dú)w因于產(chǎn)甲烷菌數(shù)量的變化[30]。因此，補(bǔ)飼精料引起甲烷菌豐度的變化是否與甲烷產(chǎn)量的變化有直接關(guān)系仍需進(jìn)一步的探討。本研究發(fā)現(xiàn)未知產(chǎn)甲烷菌屬占很高的比例，達(dá)到39.53%以上。這些數(shù)據(jù)說明，瘤胃產(chǎn)甲烷菌群落結(jié)構(gòu)的龐大信息遠(yuǎn)超出我們的認(rèn)知范圍，仍需進(jìn)一步探索。

4 結(jié)論

在細(xì)菌門水平上，放牧組和補(bǔ)飼組存在共同的優(yōu)勢菌群即擬桿菌門和厚壁菌門，補(bǔ)飼提高了擬桿菌門含量，降低了厚壁菌門含量。在科水平上，放牧組和補(bǔ)飼組豐度最高的均為普氏菌科，補(bǔ)飼后瘤胃球菌科、理研菌科和互氧菌科豐度顯著降低。

古菌中甲烷桿菌科及甲烷短桿菌屬受補(bǔ)飼精料的影響顯著升高，而甲烷八疊球菌科和甲烷微球菌屬顯著降低。