王玨，張琳，劉壯，邢華, 2，李輝，盛昊天，潘士鋒, 2*

(1. 揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；2. 江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009)

畜禽體脂的過(guò)量沉積除了嚴(yán)重降低其胴體品質(zhì)和生產(chǎn)性能以外，還與人類肥胖、Ⅱ型糖尿病和胰島素抵抗等多種代謝性疾病的多發(fā)密不可分[1-3]。有關(guān)畜禽體脂沉積方面的研究一直以來(lái)都是畜牧獸醫(yī)行業(yè)和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。體脂沉積量增加主要是脂肪細(xì)胞數(shù)目的增加、脂肪細(xì)胞容積的擴(kuò)大以及脂滴聚集共同作用的結(jié)果，其中脂肪細(xì)胞容積增大除了受脂肪細(xì)胞的成脂分化影響外，還與脂肪分解程度密切相關(guān)[4-5]。因此，在基因水平上探索影響畜禽脂肪分解的分子機(jī)理，尋找調(diào)控脂肪沉積的重要候選基因，能為畜禽肉質(zhì)性狀的改善以及人類代謝性疾病的預(yù)防提供新思路。

脂肪分解是在一系列脂肪分解酶的作用下，對(duì)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)進(jìn)行逐級(jí)水解的過(guò)程，其中激素敏感脂肪酶(hormone-sensitive triglayceride lipase, HSL)和脂肪甘油三酯脂酶(adipose triglyceride lipase, ATGL)是細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)水解的關(guān)鍵限速酶[6-7]，這兩種基因的表達(dá)變化能在一定水平上反映脂肪分解能力以及決定最終的脂質(zhì)沉積量。在脂肪細(xì)胞中，脂質(zhì)主要是以甘油三酯(triglyceride, TG)的形式儲(chǔ)存在脂滴中?；A(chǔ)狀態(tài)下，在脂滴表面覆蓋脂滴包被蛋白(Perilipin)和脂肪分化相關(guān)蛋白(adipose differentiation related protein, ADRP)，能夠形成一道“天然屏障”阻止胞液中HSL和ATGL對(duì)TG的水解，對(duì)細(xì)胞內(nèi)TG的儲(chǔ)存具有非常重要的保護(hù)作用。但是，當(dāng)細(xì)胞受到刺激導(dǎo)致脂解信號(hào)增強(qiáng)時(shí)，脂肪細(xì)胞Perilipin和ADRP表達(dá)水平降低，從而導(dǎo)致其對(duì)脂滴的保護(hù)作用大大減弱，使得HSL和ATGL大量進(jìn)入脂滴，使TG分解為甘油和游離脂肪酸[8-9]。

肌肉生長(zhǎng)抑制素(myostatin，MSTN)，是一種主要由肌肉組織分泌的蛋白質(zhì)，除對(duì)肌肉生長(zhǎng)有負(fù)調(diào)控作用外，近年來(lái)的研究表明其對(duì)脂肪組織中TG的代謝也有雙重調(diào)節(jié)作用，抑制或促進(jìn)脂肪沉積[10-12]，因此MSTN可以作為調(diào)控脂肪沉積的重要候選基因，但其具體作用及機(jī)制仍需進(jìn)一步闡明。我們前期研究表明，MSTN呈劑量依賴性抑制豬脂肪細(xì)胞的增殖和成脂分化，然而其對(duì)脂肪細(xì)胞脂解的調(diào)控作用及其分子機(jī)制尚不清楚。因此，本試驗(yàn)繼續(xù)以豬前體脂肪細(xì)胞為研究材料，以脂肪分解作為切入點(diǎn)，通過(guò)研究MSTN處理對(duì)豬脂肪細(xì)胞中TG沉積量，細(xì)胞上清中甘油和游離脂肪酸的釋放量，以及脂肪分解相關(guān)基因Perilipin、ADRP、HSL和ATGL表達(dá)的影響，深入探討其對(duì)豬脂肪細(xì)胞脂解的影響及可能的分子機(jī)制。研究結(jié)果對(duì)于篩選調(diào)控豬肉品質(zhì)的分子靶點(diǎn)具有重要意義，同時(shí)還為治療和預(yù)防人類相關(guān)疾病提供重要的理論參考。

1 材料與方法

1.1 組織來(lái)源

35日齡斷奶雄性仔豬第6～7肋骨皮下脂肪組織。

1.2 主要試劑

兔多抗(BS91052、BS8094、AP0372、BS7989)和鼠多抗(AP0060)均購(gòu)于Bioworld公司；TRIzol總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV)、RNA酶抑制劑(RNase inhibitor)、隨機(jī)引物(random hexamer primers)和SYBR GREEN(A3475L，TOYOBO，JAPAN)購(gòu)于南京生興生物技術(shù)有限公司；3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、地塞米松(DEX)和胰島素(Insulin)購(gòu)買于Sigma公司；甘油三酯定量檢測(cè)試劑盒(E1014)、RIPA裂解液(C1503)和蛋白酶抑制劑混合物(P1265)購(gòu)于北京普利萊基因技術(shù)有限公司；甘油含量測(cè)定試劑盒(F005-1-1)、BCA法蛋白定量試劑盒(#P1511)和游離脂肪酸含量測(cè)定試劑盒(A042-2-1)購(gòu)買于南京建成生物工程研究所。用于mRNA表達(dá)檢測(cè)的Perilipin、ADRP、HSL、ATGL和內(nèi)參肽基脯氨酰異構(gòu)酶(peptidylprolyl isomerase A PPI)A的PCR引物(序列見(jiàn)表1)均合成于蘇州金唯智生物科技有限公司。

表1 PCR引物序列

1.3 細(xì)胞分離及培養(yǎng)

無(wú)菌分離斷奶雄性仔豬第6～7肋骨皮下脂肪組織，用含5倍雙抗的PBS沖洗3～5次，剔除血管及筋膜，然后迅速轉(zhuǎn)移入無(wú)血清培養(yǎng)基中剪碎，剪成1 mm3的小塊即可，充分消化后，依次用50、100、200、400、600目的細(xì)胞篩過(guò)濾消化液。將過(guò)濾液進(jìn)行離心，2 000 r/min離心10 min，沉淀物用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，如此操作重復(fù)2次，獲得細(xì)胞母液。經(jīng)計(jì)數(shù)細(xì)胞后稀釋，細(xì)胞接種密度為3×104個(gè)/cm2，增殖培養(yǎng)至85%～95%融合細(xì)胞，利用“雞尾酒”法誘導(dǎo)分化，雞尾酒包含0.1 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤，0.25 μmol/L 地塞米松(DEX)，5 μg/mL 胰島素；與此同時(shí)進(jìn)行不同濃度MSTN重組蛋白的處理；試驗(yàn)共分為4組。1組為對(duì)照組，分化培養(yǎng)液(DM)+0 ng/mL MSTN重組蛋白；2、3、4組為處理組，分別為DM+25、50、100 ng/mL MSTN重組蛋白；分化48 h后收集細(xì)胞和細(xì)胞上清，進(jìn)行后續(xù)分析。

1.4 檢測(cè)MSTN處理后細(xì)胞上清中甘油和游離脂肪酸(FFA)濃度

甘油和FFA作為TG的水解產(chǎn)物，其含量是TG水解反應(yīng)程度的可靠檢測(cè)指標(biāo)。本試驗(yàn)中利用甘油和FFA含量測(cè)定試劑盒分別檢測(cè)MSTN處理48 h后細(xì)胞上清中甘油和FFA的濃度，具體操作見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書。

1.5 檢測(cè)MSTN處理后豬前體脂肪細(xì)胞中TG沉積量

使用甘油三酯定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)脂肪細(xì)胞中TG的沉積量，具體操作見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書。大致流程如下：豬前體脂肪細(xì)胞以3×104個(gè)/cm2密度進(jìn)行接種6孔板，誘導(dǎo)分化的同時(shí)，進(jìn)行不同濃度MSTN處理，48 h后吸棄上清，并用PBS洗滌2次以去除甘油，加裂解液(按比例每1×106個(gè)細(xì)胞加入0.1 mL裂解液)，混勻后室溫靜置10 min進(jìn)行裂解，離心取上清使用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)OD490，并使用BCA法蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量，以每微克蛋白濃度校正TG含量。

1.6 檢測(cè)MSTN處理后脂肪細(xì)胞脂肪分解相關(guān)基因mRNA表達(dá)

使用Trizol總RNA提取試劑盒提取細(xì)胞中總RNA(具體操作見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書)，使用Nanodrop分光光度計(jì)(ND-2000)測(cè)定總RNA的濃度和純度(A260/A280=1.8～2.0)，然后經(jīng)RNA變性膠驗(yàn)證合格后，利用M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)2 μg RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。采用熒光定量PCR方法檢測(cè)Perilipin、ADRP、HSL和ATGL基因mRNA的表達(dá)，以PPIA作為內(nèi)參。

1.7 檢測(cè)MSTN處理后脂肪分解相關(guān)基因蛋白表達(dá)

使用總蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞中總蛋白，BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，變性，-80 ℃保存?zhèn)溆?。使用Western blot方法檢測(cè)蛋白Perilipin(兔多抗1∶1 000稀釋、ADRP(兔多抗1∶500稀釋)、HSL(兔多抗1∶1 000稀釋)和ATGL(兔多抗1∶1 000稀釋)的蛋白表達(dá)水平，用β-actin(鼠多抗，1∶5 000稀釋)作為內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)化。

1.8 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 MSTN處理對(duì)豬脂肪細(xì)胞TG沉積量的影響

TG定量檢測(cè)結(jié)果表明，25、50和100 ng/mL MSTN處理組脂肪細(xì)胞中，TG沉積量均顯著低于對(duì)照組DM+0 ng/mL MSTN細(xì)胞，并且呈逐漸降低趨勢(shì)，表明MSTN處理能呈濃度依賴性抑制豬脂肪細(xì)胞內(nèi)TG沉積量(圖1)。

注：不同字母表示組間相比差異顯著(P<0.05)，n=6/組，下同圖1 MSTN處理對(duì)豬脂肪細(xì)胞中TG沉積量的影響

2.2 MSTN處理對(duì)豬脂肪細(xì)胞上清中甘油和FFA含量的影響

進(jìn)一步檢測(cè)豬脂肪細(xì)胞上清中甘油和FFA的含量，以確定脂肪細(xì)胞胞漿中TG的水解是否升高，結(jié)果如圖2所示。與對(duì)照組DM+0 ng/mL MSTN細(xì)胞相比，DM+25 ng/mL MSTN，DM+50 ng/mL MSTN和DM+100 ng/mL MSTN處理組豬脂肪細(xì)胞細(xì)胞上清中甘油和FFA的釋放量均顯著增加，且呈現(xiàn)由低濃度向高濃度逐漸升高的趨勢(shì)，表明MSTN處理顯著促進(jìn)了豬脂肪細(xì)胞內(nèi)脂肪水解過(guò)程，并且呈濃度依賴性。

圖2 MSTN處理對(duì)豬脂肪細(xì)胞上清中甘油和FFA含量的影響

2.3 MSTN處理對(duì)脂肪細(xì)胞脂解相關(guān)基因表達(dá)的影響

qRT-PCR研究結(jié)果表明，與DM+0 ng/mL MSTN的對(duì)照組細(xì)胞相比，脂滴包被蛋白Perilipin和ADRP mRNA表達(dá)水平在DM+100 ng/mL MSTN處理組細(xì)胞中均顯著降低。Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組細(xì)胞相比，DM+100 ng/mL MSTN處理顯著抑制了ADRP的蛋白表達(dá)及Perilipin蛋白的磷酸化(圖3A、B、C)。此外，脂肪分解的關(guān)鍵限速酶基因HSL和ATGL的mRNA表達(dá)量，在DM+100 ng/mL MSTN處理組細(xì)胞中顯著升高。對(duì)脂肪分解酶蛋白表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組DM+0 ng/mL MSTN細(xì)胞相比，經(jīng)DM+100 ng/mL MSTN處理組，顯著增加了HSL和ATGL脂肪分解酶的蛋白表達(dá)(圖3D、E、F)。

A. Perilipin和ADRP的mRNA表達(dá)；B、C. Perilipin和ADRP蛋白表達(dá)；D. HSL和ATGL的mRNA表達(dá)；E、F. HSL和ATGL的蛋白表達(dá)；**表示與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)；n=6/組圖3 MSTN處理對(duì)脂肪細(xì)胞脂肪分解相關(guān)基因表達(dá)的影響

3 討論

哺乳動(dòng)物的白色脂肪組織具有以脂質(zhì)形式儲(chǔ)存和釋放能量的能力，在維持機(jī)體能量平衡中起著關(guān)鍵作用[13]。脂肪組織的過(guò)量積聚(畜禽成年后主要是脂肪細(xì)胞體積增大)是導(dǎo)致肥胖及多種代謝性疾病的誘因[14]。因此，脂肪細(xì)胞是研究和開(kāi)發(fā)肥胖治療新策略的重要目標(biāo)之一。在細(xì)胞和分子水平上研究脂肪細(xì)胞增殖和肥大(脂肪細(xì)胞分化和脂肪分解)機(jī)理，通過(guò)篩選有效靶點(diǎn)調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞數(shù)目的多少和體積的大小，不僅對(duì)減少畜禽體脂沉積，提高畜禽產(chǎn)品品質(zhì)具有重要意義，而且還為人類肥胖及相關(guān)代謝性疾病的預(yù)防與治療提供重要理論依據(jù)。另外，豬是最接近人類的模式動(dòng)物，是研究人類肥胖和代謝性疾病的最理想動(dòng)物模型之一。與以往大多數(shù)脂肪代謝都以嚙齒動(dòng)物或細(xì)胞系為研究對(duì)象不同，本研究中選擇原代培養(yǎng)的豬前體脂肪細(xì)胞為研究對(duì)象，一方面因?yàn)榕c嚙齒類動(dòng)物相比，豬在解剖學(xué)和生理學(xué)上與人類的親緣關(guān)系最近，是目前公認(rèn)的研究人類代謝性疾病最為理想的動(dòng)物模型之一[15]。另一方面，與細(xì)胞系相比，原代細(xì)胞的性狀和生物學(xué)特性更接近機(jī)體的生理狀態(tài)，更有利于篩選調(diào)控脂肪細(xì)胞成脂分化和脂解的分子靶點(diǎn)。

脂肪細(xì)胞體積的增大，主要是細(xì)胞內(nèi)脂滴的體積增大導(dǎo)致的，而脂滴的主要成分是TG，TG的沉積量除了與成脂分化改變有關(guān)外，還與TG的分解程度有直接關(guān)系。課題組前期研究結(jié)果及本試驗(yàn)結(jié)果均表明，MSTN處理能呈濃度依賴性抑制脂肪細(xì)胞內(nèi)TG的沉積量，表明MSTN能顯著抑制脂肪細(xì)胞脂質(zhì)沉積，這與以往在小鼠3T3-L1前體脂肪細(xì)胞和牛前體脂肪細(xì)胞中所獲得的研究結(jié)果一致[16-19]。此外，前期的研究結(jié)果還表明，MSTN處理顯著抑制豬脂肪細(xì)胞內(nèi)TG的沉積量與脂肪細(xì)胞成脂分化標(biāo)志基因PPAR-γ及其下游脂肪合成關(guān)鍵酶FAS和ACC的mRNA和蛋白表達(dá)顯著降低密切相關(guān)，表明MSTN是通過(guò)抑制豬脂肪細(xì)胞的成脂分化，進(jìn)而減少脂肪的合成，來(lái)降低細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積累。這與其他學(xué)者在小鼠3T3-L1細(xì)胞上所得到的結(jié)果一致[16-17]。然而也有不同的看法。有研究發(fā)現(xiàn)，MSTN能通過(guò)促進(jìn)CEBP-α和PPAR-γ的表達(dá)，促進(jìn)多功能間充質(zhì)干細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞[20-22]。造成這種差異的原因可能跟細(xì)胞的種類及來(lái)源不同有關(guān)。

成熟脂肪細(xì)胞中，絕大部分空間被脂滴覆蓋，而脂滴的主要成分就是TG，在脂肪分解因素刺激下，TG可被水解為FFA和甘油。本研究結(jié)果顯示，與0 ng/mL的MSTN組相比，25、50和100 ng/mL的MSTN處理劑量依賴性增加了細(xì)胞上清中甘油和FFA的釋放量，表明MSTN處理顯著激活了脂肪細(xì)胞內(nèi)的脂肪分解過(guò)程。脂肪分解是一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控過(guò)程，涉及到幾種脂肪分解酶、輔助因子和脂滴相關(guān)蛋白的協(xié)同參與，其中HSL和ATGL是脂肪分解的兩種關(guān)鍵限速酶，其表達(dá)量的高低直接決定著脂肪分解程度。本研究發(fā)現(xiàn)，與0 ng/mL MSTN組相比，100 ng/mL的MSTN處理顯著增加了HSL和ATGL的mRNA及蛋白表達(dá)，表明MSTN處理顯著增強(qiáng)了脂肪細(xì)胞內(nèi)脂肪分解過(guò)程。前期在小鼠3T3-L1前體脂肪細(xì)胞的研究表明，MSTN處理可通過(guò)抑制PPAR-γ和CEBP-α的表達(dá)抑制脂肪生成，并促進(jìn)脂肪分解(從細(xì)胞上清中甘油和游離脂肪酸釋放量增加可知)來(lái)減少脂質(zhì)積累，這與本研究結(jié)果相同[16]。然而不同的是，在3T3-L1細(xì)胞上的研究結(jié)果表明，MSTN處理促進(jìn)脂解主要是通過(guò)增加HSL和ATGL的表達(dá)，抑制CPT1的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。本試驗(yàn)在豬脂肪細(xì)胞上的研究結(jié)果雖表明MSTN處理顯著促進(jìn)了脂解，但僅發(fā)現(xiàn)HSL和ATGL表達(dá)的升高，MSTN處理能否影響CPT1的表達(dá)還需要進(jìn)一步探討。

以往研究表明，Perilipin和ADRP是脂滴蛋白家族主要成員，基礎(chǔ)狀態(tài)下，未磷酸化的Perilipin可阻止脂肪分解酶接近脂滴，能在很大程度上抑制中性脂質(zhì)的水解。而在脂解因素刺激下，Perilipin可被PKA磷酸化，從而使可溶性的脂肪分解酶磷酸化異位至脂滴表面，此時(shí)其與磷酸化的Perilipin共定位于脂滴表面，從而刺激脂解。本研究進(jìn)一步的試驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組細(xì)胞相比，100 ng/mL的MSTN處理顯著降低了Perilipin和ADRP的mRNA及蛋白表達(dá)，表明100 ng/mL的MSTN處理導(dǎo)致脂肪細(xì)胞內(nèi)脂肪分解增強(qiáng)有可能與Perilipin和ADRP表達(dá)量的下降有密切關(guān)系。

前期的研究結(jié)果還表明，100 ng/mL的MSTN處理可通過(guò)降低PPAR-γ的mRNA及蛋白表達(dá)，顯著抑制脂肪細(xì)胞的成脂分化，這與以往在3T3-L1細(xì)胞上的研究結(jié)果一致[16]。以往研究表明，在Perlipin基因啟動(dòng)子區(qū)域，含脂肪細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子PPAR-γ結(jié)合原件(PPRE)，在分化的脂肪細(xì)胞中，Perlipin表達(dá)主要受PPAR-γ調(diào)控[23]，在3T3-L1脂肪細(xì)胞中添加PPAR-γ激動(dòng)劑，通過(guò)結(jié)合Perlipin基因啟動(dòng)子區(qū)域的PPRE，顯著上調(diào)Perlipin基因的表達(dá)。因此，結(jié)合兩部分的研究結(jié)果表明，100 ng/mL的MSTN處理后Perlipin表達(dá)量的下降有可能與PPAR-γ表達(dá)量的下降密切相關(guān)。

總之，本研究結(jié)果表明，MSTN能通過(guò)抑制脂肪細(xì)胞分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子PPAR-γ的表達(dá)，抑制脂滴表面保護(hù)性蛋白Perilipin和ADRP的表達(dá)，進(jìn)而增加脂肪分解關(guān)鍵酶基因HSL和ATGL的mRNA及蛋白表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)TG的分解，從而抑制豬脂肪細(xì)胞內(nèi)TG的沉積。研究結(jié)果為MSTN作為調(diào)控脂肪細(xì)胞脂質(zhì)沉積分子靶點(diǎn)的確認(rèn)提供理論依據(jù)。