韓紅葉，李曉雙，賈日東，許銀梅，馬曉菲，孫歡，田樹(shù)軍，4*

(1. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河北 保定 071000；2. 廊坊市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河北 廊坊 065000；3. 涿鹿縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河北 涿鹿 075699；4. 河北省牛羊胚胎工程技術(shù)研究中心，河北 保定 071000)

胚胎移植是胚胎生物技術(shù)的重要組成部分，其中以引進(jìn)品種和品種改良為主的羊胚胎移植技術(shù)研究與應(yīng)用在近年來(lái)發(fā)展迅速。胚胎移植實(shí)際上是產(chǎn)生胚胎的供體和養(yǎng)育胚胎的受體分工協(xié)作共同繁殖后代的過(guò)程[1]，胚胎移植在擴(kuò)大良種覆蓋率方面有重要作用[2-3]，被廣泛地應(yīng)用于生產(chǎn)[4]。目前，胚胎移植技術(shù)在綿羊與山羊的繁育中已體現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)越性，然而胚胎移植效果并不十分穩(wěn)定，不同研究團(tuán)隊(duì)的移植妊娠率存在較大的差異。研究發(fā)現(xiàn),移植不同等級(jí)的桑葚胚和囊胚對(duì)胚胎移植妊娠率有顯著影響[5]；不論是囊胚還是桑葚胚，其數(shù)量對(duì)胚胎移植妊娠率也有顯著影響[6]；黃體數(shù)量則對(duì)胚胎移植妊娠率沒(méi)太大影響[7]。本試驗(yàn)從胚胎因素(胚胎的發(fā)育階段、質(zhì)量、數(shù)量)和受體因素(受體羊卵巢上的黃體數(shù))分析影響綿羊胚胎移植妊娠率的主要因素，為提高綿羊胚胎移植效率提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供體羊處理

供體羊采用孕激素(P4)+促卵泡生成激素(FSH)+前列腺素(PG)法進(jìn)行超數(shù)排卵。在供體羊發(fā)情周期內(nèi)的任意一天，把孕酮栓(CIDR)放入陰道，并計(jì)為第0天，于埋栓的13～15 d，每天早晚各注射1次FSH，進(jìn)行超排處理，于15 d早晨撤去孕酮栓，同時(shí)肌肉注射氯前列烯醇 0.1 mg。供體羊發(fā)情后，用種公羊進(jìn)行自然交配，每間隔12 h配種1次，直至發(fā)情結(jié)束。在供體羊發(fā)情的第6天，采用手術(shù)法從子宮角采集胚胎。胚胎采集后，在20～25 ℃的檢胚室內(nèi)，用體視顯微鏡檢胚，并對(duì)胚胎發(fā)育階段及其質(zhì)量進(jìn)行鑒定。對(duì)其桑葚胚進(jìn)行形態(tài)學(xué)評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參考如下：A級(jí)卵裂球?qū)ΨQ，不含碎片。B級(jí)所含碎片<10%，卵裂球?qū)ΨQ或不對(duì)稱。

1.2 受體羊處理

對(duì)受體與供體同時(shí)放置孕酮栓，于埋栓第13天早晨注射PMSG 300 IU，于第15天早晨撤去孕酮栓，同時(shí)肌肉注射氯前列烯醇 0.1 mg。于撤除孕酮栓后24 h開(kāi)始，用試情公羊試情，每天早晚各試情1次，并記錄撤栓后母羊發(fā)情起始情況。

1.3 胚胎的植入

采用手術(shù)法，將新鮮胚胎移入同期發(fā)情的受體綿羊子宮角內(nèi)。所移植胚胎的供體發(fā)情時(shí)間與受體發(fā)情時(shí)間的誤差控制在12 h之內(nèi)。

1.4 妊娠診斷

在移植胚胎后的第30天，利用B超儀對(duì)受體羊進(jìn)行妊娠檢查，計(jì)算妊娠率。妊娠率(%)=(妊娠受體數(shù)/移植受體數(shù))×100。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用卡方檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性分析，P<0.05差異性顯著，P>0.05差異不顯著。

2 結(jié)果

2.1 受體卵巢上的黃體數(shù)量對(duì)妊娠率的影響

為避免胚胎因素干擾，試驗(yàn)中受體所用胚胎為相同的胚胎發(fā)育階段(桑葚胚)、胚胎數(shù)量(1枚)和胚胎質(zhì)量(A級(jí))，受體卵巢上的黃體數(shù)量對(duì)妊娠率的影響見(jiàn)表1。結(jié)果表明,受體卵巢上分別有1、2和3個(gè)黃體，其中有3個(gè)黃體的受體移植后妊娠率最高，但組間差異不顯著(P>0.05)。

表1 受體卵巢上的黃體數(shù)量對(duì)移植后妊娠率的影響

2.2 胚胎質(zhì)量對(duì)妊娠率影響

試驗(yàn)中每只受體移植胚胎數(shù)量相同(均為1枚)，胚胎發(fā)育階段均為桑葚胚，根據(jù)桑葚胚形態(tài)學(xué)評(píng)分的比較，區(qū)分出質(zhì)量不同的胚胎(A級(jí)或B級(jí))，胚胎質(zhì)量對(duì)妊娠率的影響見(jiàn)表2。結(jié)果表明,桑葚胚A級(jí)妊娠率顯著高于桑葚胚B級(jí)妊娠率(P<0.05)。

表2 胚胎質(zhì)量對(duì)妊娠率的影響

2.3 胚胎數(shù)量對(duì)妊娠率影響

胚胎處于相同發(fā)育階段和質(zhì)量等級(jí)，移植胚胎數(shù)量不同對(duì)妊娠率的影響見(jiàn)表3和表4，結(jié)果表明，移植2枚A級(jí)桑葚胚妊娠率顯著高于移植 1枚 A 級(jí)桑葚胚妊娠率(P<0.05)；移植2枚B 級(jí)桑葚胚妊娠率顯著高于移植1枚B 級(jí)桑葚胚的妊娠率(P<0.05)。

表3 移植A級(jí)桑葚胚數(shù)量對(duì)妊娠率的影響

表4 移植B級(jí)桑葚胚數(shù)量對(duì)妊娠率的影響

2.4 胚胎發(fā)育階段對(duì)妊娠率的影響

在移植胚胎數(shù)量(1枚)和質(zhì)量等級(jí)(A級(jí))相同的條件下，胚胎發(fā)育階段對(duì)妊娠率的影響見(jiàn)表5，結(jié)果表明，胚胎發(fā)育階段桑葚胚與囊胚之間組間差異不顯著(P>0.05)。

表5 胚胎發(fā)育階段對(duì)妊娠率的影響

3 討論

成熟卵泡排卵后形成黃體，黃體具有分泌孕酮維持母畜妊娠的作用，因此受體卵巢具有的黃體數(shù)越多，妊娠率越高[8]。有試驗(yàn)表明，卵巢上有2枚以上黃體的受體，移植胚胎后產(chǎn)羔率極顯著地高于有1枚黃體的受體[9]。但有些結(jié)果則顯示，受體卵巢黃體數(shù)量對(duì)其妊娠率沒(méi)有顯著影響[10-12]，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，黃體數(shù)對(duì)母羊妊娠率沒(méi)有顯著影響。

胚胎發(fā)育階段、胚胎質(zhì)量及數(shù)量的優(yōu)劣是直接影響胚胎移植成功率的重要因素。本試驗(yàn)在胚胎發(fā)育階段，囊胚與桑葚胚妊娠率差異不顯著，這與高志敏等[13]、李俊杰等[14]報(bào)道一致。此外，采胚時(shí)間宜在供體發(fā)情配種后6 d，此時(shí)胚胎大多為桑葚胚，有利于胚胎的附植。隨著胚胎質(zhì)量的下降，妊娠率也有所下降。說(shuō)明高質(zhì)量胚胎移植后受體的妊娠率較高，更適合子宮內(nèi)環(huán)境，這一結(jié)果與一些報(bào)道一致[9,15]。有報(bào)道認(rèn)為，A級(jí)桑葚胚移植的妊娠率顯著高于B級(jí)桑葚胚[16]。也有其他試驗(yàn)證明A級(jí)桑葚胚是胚胎移植的最佳時(shí)期，且受胎率非常高[17-18]。本試驗(yàn)研究也表明，移植入A級(jí)桑葚胚妊娠率(72.3%)顯著高于B級(jí)桑葚胚妊娠率(60.0%)，與上述研究結(jié)果一致。同時(shí)也就是說(shuō)明A級(jí)桑葚胚時(shí)期是最佳移植胚胎的時(shí)期。

從移植胚胎數(shù)量來(lái)看，移植胚胎的數(shù)量是決定受胎率和胚胎存活率的關(guān)鍵因素[19-20]。陳建泉等[20]認(rèn)為，移植2枚胚胎為最好，其中受體移植雙胚的妊娠率和胚胎存活率比移植單胚的高10%～15%，且2枚胚胎同時(shí)移植到黃體側(cè)，要比分別移植于兩側(cè)子宮角的妊娠率高。張金龍等[6]試驗(yàn)結(jié)果表明，不論是囊胚還是桑葚胚，均是移植2枚胚胎的妊娠率顯著高于1枚胚胎的妊娠率。本試驗(yàn)研究表明，移植1枚A級(jí)桑葚胚妊娠率(71.8%)與移植2枚A級(jí)桑葚胚妊娠率(82.4%)存在顯著性差異；移植1枚B級(jí)桑葚胚妊娠率(48.2%)顯著低于移植2枚B級(jí)桑葚胚妊娠率(58.3%)這與前人試驗(yàn)結(jié)果一致[21]。因此在實(shí)際生產(chǎn)中，宜將B級(jí)桑葚胚移雙胚，這樣可提高胚胎移植受胎率。

在本試驗(yàn)條件下，胚胎等級(jí)、移植胚胎數(shù)量是影響綿羊胚胎移植妊娠率的主要因素，而胚胎發(fā)育階段和黃體數(shù)量對(duì)妊娠率無(wú)顯著影響。