郭婷婷 ，岳成 ，徐柯 ，周玉柏

1.北京工業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，北京 100124；2.中國疾病預(yù)防控制中心 病毒病預(yù)防控制所，北京 100052

人類免疫缺陷病毒1型（human immunodefi?ciency virus type 1，HIV-1）感染導(dǎo)致的獲得性免疫缺陷綜合征（acquired immunodeficiency syn?drome，AIDS）也稱為艾滋病，是一種可通過多種途徑傳播且潛伏期較短的傳染病，目前已成為世界范圍內(nèi)威脅人類健康的重大社會和公共衛(wèi)生問題[1-2]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，2017年全球共有180萬新發(fā)病例，約94萬人死于與艾滋病相關(guān)的疾病[3]。雖然1996年進(jìn)入臨床應(yīng)用的高效抗反轉(zhuǎn)錄病毒療法（highly active antiretroviral therapy，HAART）能夠抑制HIV復(fù)制，但該療法只能部分緩解免疫失調(diào)和免疫功能喪失[4]，并不能徹底清除HIV，且治療中還會伴隨一系列諸如神經(jīng)認(rèn)知障礙、肝腎衰竭、心臟疾病等嚴(yán)重的并發(fā)癥[5-6]。從疾病控制的長遠(yuǎn)戰(zhàn)略看，研制有效的HIV疫苗，通過機(jī)體免疫獲得HIV中和抗體或特異性細(xì)胞免疫以清除體內(nèi)HIV，不失為一種預(yù)防HIV感染、控制病毒傳播，以及延緩疾病進(jìn)程的經(jīng)濟(jì)且高效的方法。

HIV在傳播和進(jìn)化過程中產(chǎn)生了不同的亞型。研究顯示，我國HIV-1的流行株雖然仍以B′/C亞型為主，但近年來AE亞型占比呈逐漸增多的趨勢[7-8]。因此，針對B′/C亞型的HIV疫苗難以滿足當(dāng)前形勢的要求。本課題組前期構(gòu)建了針對我國HIV-1 CRF01_AE亞型的HIV-gp160疫苗，但缺少評價(jià)該疫苗臨床前免疫效果的生物學(xué)工具。在本研究中，我們擬構(gòu)建并鑒定攜帶HIV-1 CRF01_AE gp160基因的細(xì)胞和小鼠模型，建立評價(jià)HIV-1 CRF01_AE亞型疫苗免疫效果的體內(nèi)外模型，為我國HIV-1 CRF01_AE亞型HIV疫苗的進(jìn)一步開發(fā)奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

C57BL/6小鼠購自并飼養(yǎng)于中國疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)動物中心；293T細(xì)胞為中國疾病預(yù)防控制中心病毒病所曾毅院士實(shí)驗(yàn)室保存；TC-1細(xì)胞（小鼠肺上皮細(xì)胞）購自北京協(xié)和醫(yī)院；大腸桿菌BMStbl3感受態(tài)細(xì)胞購自北京博邁德基因技術(shù)有限公司；攜帶密碼子優(yōu)化HIV-1 CRF01_AE亞型gp160基因的pVR-AE gp160質(zhì)粒及Lenti-X HTX慢病毒包裝系統(tǒng)均由中國疾病預(yù)防控制中心病毒病所提供；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ-HF、BamHⅠ-HF購自New England Biolabs（北京）有限公司；質(zhì)粒大量提取試劑盒QIAGEN Plamid Mega Kits、基因組DNA提取試劑盒AllPrep DNA/RNA Mini Kit均購自QIAGEN公司；引物由北京擎科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成；羅氏真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent與TRIzol試劑購自北京靜遠(yuǎn)康生物技術(shù)發(fā)展有限公司；Anti-HIV gp160抗體購自Abcam公司；FITC標(biāo)記的兔抗山羊IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；GFP（D5.1）XP抗體購自北京鴻拓嘉禾科技有限公司；多聚甲醛固定液購自Solarbio公司。

1.2 穩(wěn)定表達(dá)HIV AE gp160基因的TC-1細(xì)胞的構(gòu)建

用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ-HF和BamHⅠ-HF將HIV-1AE亞型gp160基因克隆到慢病毒穿梭質(zhì)粒pLVE-IRES-eGFP中，獲得攜帶密碼子優(yōu)化型gp160基因的重組質(zhì)粒pLVX-AE gp160；利用Lenti-X HTX慢病毒包裝系統(tǒng)與重組質(zhì)粒pLVXAE gp160共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞獲得重組慢病毒LVGFP-AE gp160。測得滴度為1.28×108TU/mL的重組慢病毒LV-GFP-AE gp160感染1×105TC-1細(xì)胞，嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)gp160基因的TC-1-HIV AE gp160細(xì)胞。

1.3 RT-PCR法檢測AE gp160基因在TC-1-HIV AE gp160細(xì)胞中的表達(dá)

提取細(xì)胞總RNA，設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物F（5'-GGA ATTCCGCCACCATGAGAGTGAGAG-3'）和 R（5'-C GGATCCTTACAACTAGAAGGCACAGCA-3'），采用TaKaRa PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2試劑盒擴(kuò)增gp160基因（RT-PCR反應(yīng)條件：50℃30 min，94℃ 2 min，94℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃1 min，30個(gè)循環(huán)）。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后送北京擎科生物技術(shù)有限公司測序。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測TC-1-HIV AE gp160細(xì)胞中Gp160蛋白的表達(dá)

收集5×105TC-1-HIV AE gp160細(xì)胞，加入終濃度為50 μg/mL的Anti-HIV gp160抗體，室溫避光孵育60 min，洗滌后加入1∶200稀釋的FITC標(biāo)記的兔抗山羊IgG（二抗），室溫孵育45 min，設(shè)置不孵育抗體的空白對照與只孵育FITC標(biāo)記的兔抗山羊IgG的陰性對照，3組洗滌后上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.5 表達(dá)AE Gp160蛋白的小鼠模型的建立及免疫組化鑒定

分別將3×105、4×105、5×105穩(wěn)定表達(dá) Gp160 蛋白的TC-1-HIV AE gp160細(xì)胞接種到C57BL/6小鼠背部，最終確定能1周成瘤的50萬個(gè)細(xì)胞數(shù)作為接種細(xì)胞數(shù)，分離接種TC-1-HIV AE gp160細(xì)胞7 d后形成的細(xì)胞團(tuán)塊，多聚甲醛4℃固定，石蠟包埋切片，非免疫正常山羊血清封閉30 min，吸除封閉液，孵育稀釋比為1∶50的GFP（D5.1）XP抗體4℃過夜，PBST沖洗5次各5 min，孵育HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育30 min，PBST沖洗5次各5 min。蘇木素溶液染色后進(jìn)行乙醇梯度水化，二甲苯透明2次各5 min，石蠟切片中央滴加中性樹脂封片觀察，PBS緩沖液做對照實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pLVX-AE gp160的酶切鑒定

用高保真酶EcoRⅠ-HF與BamHⅠ-HF雙酶切重組質(zhì)粒pLVX-AE gp160，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示gp160擴(kuò)增片段約為2600 bp，與預(yù)期一致，說明gp160基因插入慢病毒載體，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功（圖1）。

2.2 GFP熒光鑒定

測得滴度為1.28×108TU/mL的重組慢病毒LV-GFP-AE gp160感染1×105TC-1細(xì)胞，48 h后熒光顯微鏡下觀察TC-1-HIV AE gp160細(xì)胞呈現(xiàn)較強(qiáng)的綠色熒光，說明外源基因可以在重組慢病毒中表達(dá)（圖2）。

2.3 RT-PCR鑒定TC-1-AE gp160細(xì)胞

RT-PCR結(jié)果見圖3，擴(kuò)增的gp160基因片段約為2600 bp，說明gp160基因成功插入TC-1-HIV AE gp160細(xì)胞基因組。

圖1 重組質(zhì)粒pLVX-AE gp160的酶切鑒定

圖2 TC-1-HIV AE gp160細(xì)胞熒光圖

圖3 TC-1-HIV AE gp160細(xì)胞的RT-PCR鑒定

2.4 流式細(xì)胞術(shù)鑒定TC-1-AE gp160細(xì)胞

收集TC-1-HIV AE gp160細(xì)胞總蛋白，設(shè)置的空白對照（圖4A、B）與陰性對照（圖4C、D）組只出現(xiàn)1個(gè)峰值，說明無熒光信號；實(shí)驗(yàn)組與對照組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，圖4E、F結(jié)果表明TC-1-HIV AE gp160細(xì)胞中有較強(qiáng)的熒光信號，即外源基因表達(dá)的Gp160蛋白可以在TC-1-HIV AE gp160細(xì)胞表面暴露。

2.5 免疫組化鑒定表達(dá)AE Gp160蛋白的小鼠模型

免疫組化及HE染色結(jié)果顯示，小鼠體內(nèi)接種的TC-1-HIV AE gp160細(xì)胞能形成細(xì)胞團(tuán)塊，TC-1-HIV AE gp160細(xì)胞團(tuán)塊呈紅褐色，而對照組組織中無色，表明外源基因可以在小鼠體內(nèi)形成的細(xì)胞團(tuán)塊中表達(dá)，提示可能成功構(gòu)建了表達(dá)外源基因的小鼠模型（圖5）。

3 討論

艾滋病是一種傳染性較強(qiáng)且潛伏期短的傳染病，缺少特效治療藥物。目前有效的疫苗接種仍是HIV-1感染導(dǎo)致的艾滋病的最主要的治療方法，其中對治療性疫苗的研發(fā)最多。截至2017年4月3日，國際艾滋病疫苗促進(jìn)組織的研發(fā)數(shù)據(jù)庫中有43個(gè)艾滋病候選疫苗進(jìn)入臨床試驗(yàn)[9]，其中Ⅰ期31個(gè)、Ⅰ/Ⅱ期3個(gè)、Ⅱ期8個(gè)、Ⅲ期1個(gè)。HIV疫苗的研發(fā)主要以HIV結(jié)構(gòu)基因?yàn)榘悬c(diǎn)，HIV結(jié)構(gòu)基因env表達(dá)的膜蛋白Gp160可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，在艾滋病相關(guān)免疫治療中被認(rèn)為是良好的靶抗原。研究表明，進(jìn)行艾滋病疫苗研究、藥物治療和發(fā)病機(jī)制研究的必要條件之一是細(xì)胞模型和動物模型的構(gòu)建。艾滋病疫苗研發(fā)的主要障礙之一是HIV的高效變異性，因而缺乏有效的動物模型[10]?？紤]到經(jīng)濟(jì)效應(yīng)及遺傳、代謝、免疫等研究進(jìn)展，小鼠作為模式動物成為艾滋病疫苗模型研究的焦點(diǎn)。小鼠本身沒有CD4特異性受體，無法直接用于HIV-1的感染研究[11]，但可作為靶向疫苗的評價(jià)模型動物，為疫苗的臨床前效果評價(jià)提供了研究模型。對于HIV疫苗的臨床前效果評價(jià)，攜帶靶抗原的小鼠模型尤為重要。目前關(guān)于檢測HIV疫苗的靶向治療效果已有針對小鼠模型建立的研究。TC-1在細(xì)胞模型中廣泛用于疫苗特異性免疫應(yīng)答評價(jià)和體外抗腫瘤效果評價(jià)，均為本實(shí)驗(yàn)的可行性提供了有益參考。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的TC-1-HIV AE gp160小鼠模型和體外細(xì)胞模型，目的是滿足前期已構(gòu)建的HIV疫苗的免疫評價(jià)需要，進(jìn)一步完善HIV疫苗評價(jià)模型的相關(guān)研究。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測TC-1-HIV AE gp160細(xì)胞gp160基因表達(dá)

圖5 GFP蛋白在小鼠組織中的表達(dá)（HE染色和IHC）

慢病毒載體基于HIV-1發(fā)展而來，該載體能夠使外源基因整合到宿主細(xì)胞基因組中，并隨細(xì)胞基因組的分裂而分裂，過程持續(xù)且穩(wěn)定。本研究選用慢病毒pLVX包裝系統(tǒng)，構(gòu)建攜帶gp160基因的小鼠模型。首先用慢病毒載體構(gòu)建重組質(zhì)粒，利用慢病毒包裝系統(tǒng)Lenti-X HTX，通過細(xì)胞內(nèi)同源重組獲得攜帶靶基因gp160的重組慢病毒，重組慢病毒感染小鼠細(xì)胞TC-1，外源基因gp160以轉(zhuǎn)座子的形式插入小鼠腫瘤細(xì)胞TC-1的基因組，經(jīng)嘌呤霉素抗性篩選后獲得表達(dá)外源基因gp160的TC-1細(xì)胞。為成功構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)Gp160蛋白的小鼠模型，選擇2種小鼠腫瘤細(xì)胞系，分別是P815（小鼠肥大腫瘤細(xì)胞）及TC-1（小鼠肺上皮腫瘤細(xì)胞），目的是為防止后期免疫小鼠出現(xiàn)排斥反應(yīng)。但是，由于攜帶gp160基因的P815細(xì)胞中Gp160蛋白表達(dá)不穩(wěn)定，經(jīng)抗性篩選后外源基因容易丟失，因此選擇了生長速度快且經(jīng)抗性篩選后仍穩(wěn)定表達(dá)Gp160的TC-1細(xì)胞。將50萬個(gè)穩(wěn)定表達(dá)Gp160的TC-1細(xì)胞接種C57BL/6小鼠，免疫組化及HE染色結(jié)果顯示，小鼠體內(nèi)接種的TC-1-HIV AE gp160細(xì)胞能形成細(xì)胞團(tuán)塊，且可能有Gp160蛋白表達(dá)。

綜上，我們建立了穩(wěn)定表達(dá)Gp160蛋白的小鼠模型和體外細(xì)胞模型，為HIV-1相關(guān)疫苗臨床前的全面評價(jià)提供了模型，也為HIV-1相關(guān)疫苗的臨床申請?zhí)峁┝藬?shù)據(jù)支持。