侯江厚 ，張靈霞 ，黃國紅 ，詹曉燕 ，楊奕梅

1.昆明市婦幼保健院，云南 昆明 650013；2.解放軍總醫(yī)院 第八醫(yī)學(xué)中心，北京 100091

新型冠狀病毒?。–OVID-19）是由新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）感染引起的一種傳染性極高的呼吸系統(tǒng)性疾病，自2019年12月出現(xiàn)以來，該病在全球范圍內(nèi)迅速蔓延。重癥COVID-19患者可導(dǎo)致多器官損傷和衰竭，最終死亡[1]。目前，針對COVID-19的治療還沒有特效藥物，病毒的傳染源、中間宿主以及潛伏期等諸多因素的不明確也將導(dǎo)致本次新冠疫情的防控面臨巨大的壓力和挑戰(zhàn)，因此，研發(fā)高效的抗病毒藥物是對抗SARS-CoV-2感染的關(guān)鍵。SARS-CoV-2的基因圖譜、蛋白結(jié)構(gòu)和入侵受體等生物學(xué)相關(guān)機(jī)制都相繼被快速探明，為抗病毒藥物的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)[2]。SARS-CoV-2表面的刺突（spike，S）蛋白是病毒打開宿主細(xì)胞大門的“鑰匙”，S蛋白通過與宿主細(xì)胞表面的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（angioten?sin converting enzyme 2，ACE2）受體結(jié)合，介導(dǎo)SARS-CoV-2感染的第一步[3]。自然狀態(tài)下S蛋白以一種相對穩(wěn)定的同源三聚體形式存在，當(dāng)S蛋白與ACE2結(jié)合時，S蛋白三聚體與ACE2二聚體之間有多個基團(tuán)相互作用，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)吞而增強病毒入侵過程。S蛋白由S1和S2兩部分組成，其中S1組成棘突的頭部，受體結(jié)合域（receptor binding domain，RBD）位于S1區(qū)域表面，其受體結(jié)合基序（receptor binding motif，RBM）僅有數(shù)個氨基酸[4]。阻斷病毒和宿主細(xì)胞受體的結(jié)合可以阻止病毒入侵，是抗病毒藥物研發(fā)策略之一，阻斷S蛋白RBD是阻止SARS-CoV-2感染的關(guān)鍵，是抗COVID-19藥物研發(fā)的重要靶點。抗體或小分子化合物通過與S蛋白RBD靶向結(jié)合，抑制或阻斷RBD與ACE2的結(jié)合，從而抑制SARS-CoV-2進(jìn)入宿主細(xì)胞，避免宿主細(xì)胞感染[5]。

為了獲得RBD完整肽段，我們利用原核表達(dá)系統(tǒng)，采用基因重組方法獲得重組RBD肽。蛋白的天然構(gòu)象是保持該蛋白天然活性的前提，結(jié)構(gòu)中二硫鍵的正確配對往往代表著蛋白正確的空間折疊方式。為了獲得具有天然構(gòu)象的RBD肽并提高重組蛋白的表達(dá)量，我們采用與DsbC蛋白融合表達(dá)的方式，充分利用DsbC分子伴侶和二硫鍵異構(gòu)酶的作用[6]。同時，為了得到?jīng)]有冗余氨基酸的RBD肽，以便在后續(xù)抗體制備、配基篩選及抗病毒藥物篩選時能夠提高特異性，在其氨基酸序列的N端引入腸激酶位點，通過原核重組表達(dá)并采用腸激酶酶切和二次純化的方法獲得高純度的RBD肽。本研究獲得的RBD肽位于S蛋白Gly319～Asn541，全長223個氨基酸殘基。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌BL21（DE3）及其感受態(tài)細(xì)胞、原核表達(dá)載體pET-DsbC由本室制備保存；全基因與引物合成、測序由北京華大基因公司完成；PCR試劑購自上海生工生物有限公司；質(zhì)粒提取、膠回收等常規(guī)分子生物學(xué)實驗試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶購自NEB公司；蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量marker購自北京索萊寶生物公司；重組腸激酶由本室表達(dá)純化；Ni-Sepharose chelating Sepharose Fast Flow親和樹脂填料購自中原合聚生物科技公司，本室裝填純化柱；LB培養(yǎng)基、PBS緩沖液配制試劑等其他試劑為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 全基因與引物合成

參照GenBank登錄號（MN908947.3）對SARSCoV-2的S蛋白氨基酸序列進(jìn)行分析，其RBD氨基酸為Gly319～Asn541。為了獲得沒有冗余氨基酸的RBD，保持此肽段正確的空間折疊和生物活性，選定此區(qū)域肽段，同時在N端加入腸激酶序列DDDDK。融合蛋白對應(yīng)的核酸序列按照利于原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的原則進(jìn)行優(yōu)化和全基因合成，在對應(yīng)的核酸兩端分別加入限制性內(nèi)切酶HindⅢ和XhoⅠ位點序列，3'端加入大腸桿菌終止密碼子taa。

1.3 pET-DsbC-RBD表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和XhoⅠ雙酶切全基因合成的克隆載體pUC-RBD，紫外燈下切下RBD核酸片段并進(jìn)行膠回收，對表達(dá)載體pET-DsbC同樣以HindⅢ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切和膠回收，16℃條件下采用T4DNA連接酶對核酸片段和酶切后的載體進(jìn)行混合連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21（DE3），鋪含卡那霉素的固體平板，次日挑選克隆進(jìn)行菌落PCR，篩選陽性克隆，PCR產(chǎn)物行1%瓊脂糖凝膠電泳，判斷產(chǎn)物大小。對陽性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)并測序，測序正確的菌株保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 DsbC-RBD融合蛋白的原核重組表達(dá)與初步純化

取測序正確的陽性工程菌株于37℃振蕩過夜培養(yǎng)進(jìn)行活化，隔日按1∶100的比例轉(zhuǎn)接至含50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，檢測細(xì)菌生長密度，菌液D600nm值約為0.4時加入IPTG（終濃度為0.5 mmol/L），30℃振蕩誘導(dǎo)10 h，6000 r/min離心5 min收集菌體，加入1×PBS充分混勻，在冰水狀態(tài)下超聲波破碎菌體，12 000 r/min離心30 min，分別取上清和沉淀進(jìn)行12%的SDSPAGE，分析重組DsbC-RBD的表達(dá)形式。

取超聲波破碎后的離心上清，以1 mL/min的速度結(jié)合鎳離子螯合的親和層析柱，PBS緩沖液緩慢平衡層析柱5個柱體積至基線處于水平狀態(tài)，以50 mmol/L咪唑除去菌體自身雜蛋白，150 mmol/L咪唑洗脫收集目的蛋白，收集2次的洗脫液加入變性緩沖液，煮沸10 min，12% SDS-PAGE分析重組DsbC-RBD的純度。純化后的重組蛋白以水充分透析，凍干保存。

1.5 重組DsbC-RBD融合蛋白的腸激酶酶切

取凍干后的DsbC-RBD粉末，用PBS稀釋至1 mg/mL，加入腸激酶，比例為 1∶3000，充分混勻。為了最大限度地保持RBD肽的生物活性，選擇酶切溫度為4℃，酶切時間為隔夜10 h，酶切后取混合樣品進(jìn)行15% SDS-PAGE分析酶切效率、酶切特異性和目的蛋白RBD的相對分子質(zhì)量。

1.6 目的RBD肽的二次親和純化

分子伴侶蛋白DsbC和腸激酶的N端均帶有6×His標(biāo)簽，通過親和柱層析除去酶切后的DsbC蛋白和腸激酶，采用鎳離子螯合的親和層析方法對酶切后的RBD肽混合液進(jìn)行分離提純。取酶切后融合蛋白混合液，以1 mL/min的速度重復(fù)結(jié)合鎳離子螯合的親和層析柱3次，小心收集穿過液，取穿過液，15% SDS-PAGE分析純化后RBD肽的純度和相對分子質(zhì)量，計算目的蛋白RBD肽酶切后的純化得率，對純化后的RBD肽充分水透析后，凍干保存?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果

2.1 SARS-CoV-2 S蛋白RBD全基因合成

參考GeneBank公布的SARS-CoV-2 S蛋白氨基酸序列，選擇Gly319～Asn541序列，根據(jù)有利于原核系統(tǒng)表達(dá)的原則，采用氨基酸密碼子同義置換，對RBD肽段對應(yīng)的核酸進(jìn)行全基因合成，在該肽段的N端加腸激酶序列DDDDK。合成的序列全長包含699個核苷酸，序列如下：

2.2 重組pET-DsbC-RBD表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

用內(nèi)切酶HindⅢ和XhoⅠ雙酶切合成載體pUC-RBD，將酶切的RBD核酸片段克隆到表達(dá)載體pET-DsbC上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），鋪固體平板，以合成的鑒定引物采用菌落PCR方法篩選陽性克隆，1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1，在預(yù)期的約700 bp處有單一條帶，經(jīng)測序與合成序列完全一致。

2.3 DsbC-RBD融合蛋白的原核表達(dá)及親和純化

取測序正確的工程菌株擴(kuò)大培養(yǎng)，30℃條件下隔夜誘導(dǎo)，取誘導(dǎo)后的菌體超聲波破碎，高速離心30 min后，取上清和沉淀進(jìn)行12%的SDS-PAGE，結(jié)果如圖2。融合蛋白的相對分子質(zhì)量為58×103，和預(yù)期一致，表達(dá)量占菌體總蛋白的30%以上，分別存在于超聲波裂解后的上清和沉淀中。由于可溶性表達(dá)往往代表蛋白正確的折疊方式，RBD上清存在形式保證結(jié)構(gòu)區(qū)的空間構(gòu)象，保證后期抑制劑篩選的特異性。

取超聲波裂解后的上清，以緩慢的速度流經(jīng)His標(biāo)簽親和層析柱，再用PBS緩沖液平衡到基線水平，分別用50 mmol/L咪唑洗脫雜蛋白、150 mmol/L咪唑洗脫收集目的蛋白，12% SDS-PAGE結(jié)果如圖3。經(jīng)親和層析后，DsbC-RBD融合蛋白純度在90%以上，純化后的融合蛋白經(jīng)水透析，凍干保存。

2.4 DsbC-RBD重組融合蛋白的腸激酶酶切

圖1 RBD核酸片段菌落PCR凝膠電泳鑒定結(jié)果

圖2 DsbC-RBD原核表達(dá)產(chǎn)物表達(dá)形式分析

圖3 DsbC-RBD融合蛋白親和純化電泳分析

充分考慮酶切后RBD肽段的生物功能，避免較高溫度對RBD肽段生物活性的影響，腸激酶酶切只在4℃條件下進(jìn)行，酶切時間設(shè)為8 h。取酶切后混合樣品以15% SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖4，此條件下酶切效率為100%，沒有產(chǎn)生非特異酶切現(xiàn)象，酶切后顯示RBD肽相對分子質(zhì)量約為25×103，與理論值一致。

2.5 重組RBD肽的純化

采用鎳離子螯合親和層析對酶切后蛋白混合液中的RBD肽進(jìn)行分離提純，腸激酶酶切后蛋白混合液以緩慢的速度反復(fù)結(jié)合親和層析柱，收集流穿液以15% SDS-PAGE鑒定回收RBD肽的純度，結(jié)果如圖5，純化后的RBD肽相對分子質(zhì)量約為25×103，同預(yù)期一致，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色鑒定，純度大于92%，計算得率為30%，得率較低。

3 討論

圖4 DsbC-RBD融合蛋白腸激酶酶切電泳分析

圖5 RBD肽親和純化電泳分析

阻斷病毒和宿主細(xì)胞受體的結(jié)合可以阻止病毒入侵，是抗病毒藥物研發(fā)策略之一，包括靶向病毒或宿主細(xì)胞的受體。SARS-CoV-2具有傳染性極強和潛伏時間長短不一的特點，同時，病毒真正的傳染源及中間宿主也未明確，病毒存在變異風(fēng)險等，都導(dǎo)致SARS-CoV-2疫情防控具有諸多不確定因素，因此研發(fā)SARS-CoV-2預(yù)防和治療性疫苗或高效抗病毒藥物迫在眉睫。目前COVID-19仍沒有特異治療方法和抗病毒治療藥物，MARS-CoV的動物模型研究和COVID-19疫情中康復(fù)病人血清的救治均顯示，阻斷入侵策略對冠狀病毒可能有效，S蛋白RBD的阻斷是阻止SARS-CoV-2感染的關(guān)鍵，是抗COVID-19藥物研發(fā)的重要靶點。SARS-CoV-2的S蛋白是一種糖蛋白，有3個RBD，內(nèi)部有二硫鍵連接，在β冠狀病毒屬中保守[7]。RBD結(jié)構(gòu)靠近cryo-EM三聚體的中央部位，使S蛋白形成易于和宿主受體ACE2結(jié)合的空間構(gòu)象，SARS-CoV-2與受體ACE2的結(jié)合能力比SARS-CoV更強，更具傳染性[8]。RBD是誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生，阻斷病毒結(jié)合，刺激宿主免疫反應(yīng)、中和抗體及保護(hù)免疫系統(tǒng)免受病毒感染的主要抗原成分?？贵w或小分子化合物通過與S蛋白RBD的靶向結(jié)合，抑制或阻斷RBD結(jié)合功能，可特異性阻斷RBD與ACE2的結(jié)合，從而抑制SARS-CoV-2進(jìn)入宿主細(xì)胞，避免宿主細(xì)胞感染。

目前已有商品化的RBD肽，但價格較昂貴，同時大都采用與人Fc蛋白融合表達(dá)，主要用于抗原抗體血清學(xué)檢測，而高純度的RBD肽是后續(xù)抗體制備、配基篩選和藥物篩選驗證的基礎(chǔ)和保證。為了獲得高純度的重組RBD肽，我們根據(jù)原核系統(tǒng)的特點對氨基酸的密碼子組成進(jìn)行了同義置換，以利于原核系統(tǒng)的表達(dá)；原核系統(tǒng)內(nèi)的高表達(dá)是后續(xù)純化獲得高純度重組蛋白的基礎(chǔ)，采用融合表達(dá)方式，兼并考慮RBD肽存在的二硫鍵，在RBD的N端加入同時具有伴侶蛋白和二硫鍵異構(gòu)酶作用的DsbC蛋白進(jìn)行融合表達(dá)，使得融合蛋白的表達(dá)量達(dá)到總蛋白的30%以上，并獲得了部分可溶性表達(dá)，提示獲得的RBD肽可能具有天然空間結(jié)構(gòu)和正確的二硫鍵配對；其次，在RBD肽的N端加入腸激酶切點，在目前已經(jīng)很成熟的腸激酶酶切工藝下，通過二次純化獲得了重組RBD肽，該重組RBD肽不含冗余氨基酸，具有結(jié)構(gòu)完整性，在抗體制備和抗病毒藥物篩選時將具有較強的特異性。本方法獲得的RBD肽純度為92%，水溶性較好，但得率較低。高純度的RBD肽為隨后開展以RBD肽為靶標(biāo)進(jìn)行相關(guān)抑制劑篩選和機(jī)制研究提供了可靠的保證，也為臨床以RBD肽為重組抗原進(jìn)行血清學(xué)抗體診斷提供了原料。