宮能靜,姜玉玉,李小雨,高嬌嬌,程向陽

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院麻醉科,蚌埠 233030;*通訊作者,E-mail:yxhyhr@163.com)

急性心肌梗死是世界范圍內(nèi)常見的心血管疾病[1]。梗死后血流量的恢復(fù)加重了組織和器官的損傷,稱為缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)損傷[2]。體內(nèi)和體外的研究顯示,I/R損傷的潛在機制包括氧化應(yīng)激、線粒體功能受損,自由基產(chǎn)生過多,最終導(dǎo)致細胞凋亡[3-5]。到目前為止,尚無有效的預(yù)防心肌I/R損傷的治療方法。因此,充分理解I/R損傷的復(fù)雜分子機制,尋找有效的克服I/R損傷后細胞凋亡的方法仍需要很大的努力。

miRNAs是一類高度保守的非編碼RNA,通過在轉(zhuǎn)錄后水平抑制基因的表達,參與了幾乎所有細胞過程[6]。越來越多的證據(jù)表明,miRNA表達失調(diào)與多種人類心血管疾病有關(guān),包括心肌I/R損傷[7]。例如,miR-873通過Egln3而抑制H/R心肌細胞凋亡[8];過表達miR-124-3p可下調(diào)RIPK1表達,減輕心肌細胞H/R損傷,從而發(fā)揮心肌保護作用[9]。這些miRNA可能成為缺血性心臟病治療的潛在靶點。有研究表明,在肺動脈高壓大鼠的左右心室組織中,miR-702-3p表達升高[10],然而miR-702-3p在心肌梗死中的作用卻未見報道。

乙醛脫氫酶2(aldehyde dehydrogenase 2,ALDH2)是線粒體中重要的ALDH家族成員,其對心臟的保護作用已在各種模型中得到證實,包括心肌急性缺血/再灌注損傷[11,12]。通過靶基因預(yù)測網(wǎng)站Targetscan,預(yù)測ALDH2可能是miR-702-3p的靶基因。前期的研究表明,心肌細胞轉(zhuǎn)染miR-702-3p inhibitor后ALDH2蛋白的表達升高,然而,miR-702-3p是否通過ALDH2調(diào)控心肌梗死后細胞凋亡仍不清楚。在本研究通過構(gòu)建缺氧/復(fù)氧(H/R)心肌細胞體外模型研究miR-702-3p在心肌I/R損傷過程中的抗凋亡作用,并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要試劑

1-3日齡雄性SD大鼠乳鼠,SPF級,購于蚌埠醫(yī)學(xué)院實驗動物中心,合格證號:20180004002485。Ⅱ型膠原酶購自北京solarbio公司;Lipofectamin 2000轉(zhuǎn)染試劑、Trizol試劑購自美國Invitrogen公司;聚偏二氟乙烯膜(PVDF)購自美國Milipore公司;miR-702-3p抑制物(inhibitor),miR-702-3p引物購自上海吉瑪公司;RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量試劑盒均購自廣州GeneCopoeia公司;雙熒光素酶報告基因質(zhì)粒載體購自美國Promega公司;Annexin Ⅴ-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物公司;兔多克隆抗ALDH2抗體購自美國Abcam公司;兔多克隆抗Bcl-2、Bax、cleaved Caspase-3、GAPDH抗體購自美國Affinity公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗購自Biosharp公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

將1-3日齡乳鼠置于75%酒精浸泡消毒2 min,無菌取心尖組織,以預(yù)冷PBS清洗3次,剪成約1 mm3大小的碎塊,經(jīng)含0.08%胰蛋白酶和1%Ⅱ型膠原酶的混合酶37 ℃消化5 min,輕輕吹打后收集細胞懸液;同法反復(fù)消化4-5次,取各次的細胞懸液與等體積含20%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基混勻終止消化,以900 r/min離心5 min,棄掉上清,將沉淀與含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基混合,用200目濾網(wǎng)過濾后將懸液轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶,于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)90 min進行差速貼壁后,吸取細胞懸液,以密度為5×105接種于6孔板,同時加入0.1 mmol/L Brdu(抑制心肌成纖維細胞生長),置于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每隔24 h換液,待細胞密度達到70%時,進行后續(xù)實驗。

1.3 心肌細胞缺氧/復(fù)氧模型的建立

待細胞密度為70%左右時,建立缺氧/復(fù)氧模型。吸棄6孔板中的培養(yǎng)基,PBS沖洗2次,換無糖DMEM培養(yǎng)基,置入含1%O2和5%CO2的缺氧培養(yǎng)箱,在37 ℃條件下缺氧3 h,然后將6孔板取出,置換DMEM/F12完全培養(yǎng)液,并于5% CO2,37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h進行復(fù)氧處理[13]。

1.4 細胞轉(zhuǎn)染及分組

取對數(shù)生長期心肌細胞,將細胞隨機分為正常對照組(CON)、缺氧復(fù)氧組(H/R)、H/R+miR-702-3p inhibitor NC轉(zhuǎn)染組(H/R+inhibitor NC)、H/R+miR-702-3p inhibitor轉(zhuǎn)染組(H/R+inhibitor)。參照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑說明書向心肌細胞分別轉(zhuǎn)染miR-702-3pinhibitor NC及miR-702-3pinhibitor,轉(zhuǎn)染6 h后將培養(yǎng)基更換為含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h進行H/R處理。H/R處理完成后即可進行后續(xù)實驗。

1.5 CCK-8實驗檢測心肌細胞活力

將原代培養(yǎng)心肌細胞用胰蛋白酶消化并重懸,將細胞以5×103個細胞/孔接種于96孔板,放入5% CO2,37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。各組進行轉(zhuǎn)染及H/R處理后,每孔加入10 μl CCK-8溶液,37 ℃避光孵育2 h,酶標(biāo)儀檢測450 nm處吸光度(OD)值。

1.6 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡

轉(zhuǎn)染及建立缺氧/復(fù)氧損傷模型后,收集各組心肌細胞,加入195 μl Annexin Ⅴ-FITC結(jié)合液重懸細胞,調(diào)整細胞密度(1×106個/ml),吸取1 ml細胞懸液加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC,混勻后加入10 μl碘化丙啶染色液,輕輕混勻,20-25 ℃避光孵育20 min,流式細胞儀檢測凋亡率。

1.7 qRT-PCR檢測細胞中miR-702-3p表達水平

轉(zhuǎn)染及建立缺氧/復(fù)氧損傷模型后,收集各組心肌細胞,利用Trizol提取細胞總RNA,定量后吸取1 μg總RNA產(chǎn)物,按照廣州GeneCopoeia公司miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板,按照廣州GeneCopoeia公司miRNA qPCR kit說明書進行qRT-PCR反應(yīng),反應(yīng)體系共20 μl,反應(yīng)條件如下:95 ℃預(yù)熱10 min(循環(huán)1次);95 ℃變性10 s,59 ℃退火20 s,72 ℃延伸10 s(循環(huán)40次)。以U6為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法計算miR-702-3p的相對表達水平。

引物序列如下:miR-702-3p Forward:GCCGAGTGCCCACCCTTAC,Reverse:CTCAACTGGTGTCGTGGA;U6 Forward:GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT,Reverse:CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT。

1.8 Western blot檢測ALDH2、Bcl-2、Bax,cleaved Caspase-3蛋白的表達

轉(zhuǎn)染及H/R造模后,收集各組心肌細胞,加入RIPA裂解液提取細胞總蛋白,BCA法測定蛋白濃度。取30 μg總蛋白SDS-PAGE分離、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂牛奶封閉,孵育一抗,包括兔源ALDH2(1 ∶1 000)、兔源Bcl-2(1 ∶1 000)、兔源Bax(1 ∶1 000)和兔源GAPDH(1 ∶3 000),4 ℃孵育過夜,加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(1 ∶10 000)孵育1 h。ECL顯影,放入Western blot成像系統(tǒng)曝光,顯影。Image J軟件用來分析蛋白的相對表達水平,GAPDH作為內(nèi)參。

1.9 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?/h3>

利用Targetscan分析miR-702-3p與ALDH2的3′UTR可能的結(jié)合位點,將含有miR-702-3p結(jié)合位點野生型(wild type,WT)和突變型(mutant type,MUT)的ALDH2 3′UTR基因序列插入pGL3熒光素酶報告基因載體,分別構(gòu)建野生型(WT-ALDH2)與突變型(MUT-ALDH2)的ALDH2 3′UTR熒光素酶報告質(zhì)粒載體,將WT-ALDH2、MUT-ALDH2分別與miR-702-3p mimics、miR-NC共轉(zhuǎn)染48 h收集細胞,采用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測熒光素酶活性。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間比較采用t檢驗,兩組以上比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 H/R處理對心肌細胞中miR-702-3p表達的影響

采用qRT-PCR檢測miR-702-3p在H/R處理后的表達情況。與對照組相比,H/R組miR-702-3p的表達水平顯著升高(P<0.01,見圖1)。

與對照組相比,* * P <0.01圖1 H/R處理后心肌細胞中miR-702-3p的相對表達Figure 1 Relative expression of miR-702-3p in cardiomyocytes after H/R treatment

2.2 miR-702-3p對心肌細胞活力、細胞凋亡的影響

為了確定miR-702-3p在細胞活力和凋亡中的作用,通過轉(zhuǎn)染miR-702-3p inhibitor,使miR-702-3p表達下調(diào)。結(jié)果顯示,miR-702-3p inhibitor轉(zhuǎn)染顯著降低了心肌細胞中miR-702-3p的表達水平(P<0.01,見圖2A)。CCK-8實驗檢測miR-702-3p下調(diào)對細胞活力的影響,結(jié)果表明,miR-702-3p下調(diào)可以顯著減輕H/R處理對細胞活力的影響(P<0.05,見圖2B),而轉(zhuǎn)染miR-702-3p NC對H/R處理心肌細胞的生存能力并沒有影響。此外,利用流式細胞術(shù)檢測miR-702-3p下調(diào)后心肌細胞的凋亡率,結(jié)果表明,缺氧顯著升高了心肌細胞的凋亡,而轉(zhuǎn)染miR-702-3p inhibitor后,心肌細胞凋亡率顯著下降;轉(zhuǎn)染miR-702-3p NC對細胞凋亡并沒有影響(見圖3)。

圖2 miR-702-3p對心肌細胞活力、細胞凋亡的影響Figure 2 The effect of miR-702-3p on cardiomyocyte viability and apoptosis

圖3 miR-702-3p inhibitor對H/R處理心肌細胞凋亡的影響Figure 3 Effect of miR-702-3p inhibitor on apoptosis of cardiomyocytes after H/R treatment

2.3 miR-702-3p對心肌細胞凋亡相關(guān)蛋白和ALDH2蛋白表達的影響

Western blot結(jié)果顯示,心肌細胞在H/R處理后,Bax和cleaved Caspase-3表達升高,Bcl-2表達下降,ALDH2表達降低。在H/R刺激的心肌細胞中,miR-702-3p inhibitor轉(zhuǎn)染顯著逆轉(zhuǎn)了H/R刺激引起的變化(見圖4)。

圖4 Western blot檢測心肌細胞中凋亡相關(guān)蛋白和ALDH2蛋白的表達Figure 4 Expression of apoptosis-related proteins and ALDH2 in cardiomyocytes after different treatment by Western blot

2.4 miR-702-3p與ALDH2 3′UTR的作用關(guān)系

通過TargetScan預(yù)測ALDH2為miR-702-3p的靶基因(見圖5A)。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示,共轉(zhuǎn)染miR-702-3p mimics、WT-ALDH2組的熒光素酶活性明顯降低(P<0.01);而共轉(zhuǎn)染miR-702-3p、MUT-ALDH2組的熒光素酶活性無明顯變化(P>0.05,見圖5B)。

圖5 ALDH2是miR-702-3p的靶基因Figure 5 ALDH2 is a target gene of miR-702-3p

3 討論

心肌缺血后血流量的恢復(fù)加重了組織和器官的損傷,稱為心肌缺血再灌注(I/R)損傷[2]。凋亡被認為是心肌I/R損傷的主要病理生理機制之一,并被認為是導(dǎo)致心肌I/R損傷后細胞死亡的主要因素[14]。調(diào)節(jié)細胞凋亡被認為是一種很有前途的心血管疾病治療策略。心肌細胞為終末分化細胞,其凋亡后導(dǎo)致的心肌損傷是不可逆的。本研究證實了在H/R條件下,細胞凋亡明顯增加。

miRNA已經(jīng)成為多種心血管疾病過程中的重要介質(zhì),可能成為心血管疾病的治療靶點[15]。許多miRNA,如miR-26a-5p[16]和miR-30b-5p[17]都與心肌I/R損傷有關(guān)。據(jù)報道,miR-702-3p在丙泊酚麻醉的腦組織以及在肺動脈高壓的大鼠心肌組織中表達升高[10,18]。因此,我們推測miR-702-3p可能在心肌I/R損傷中發(fā)揮作用。本實驗重點研究了H/R條件下miR-702-3p在心肌細胞中的作用。將心肌細胞進行H/R處理模擬心肌I/R損傷,結(jié)果顯示,在H/R條件下miR-702-3p表達顯著升高。下調(diào)miR-702-3p可以減輕缺氧誘導(dǎo)的細胞損傷,細胞活力增加,凋亡率降低,提示下調(diào)miR-702-3p在H/R誘導(dǎo)的心肌細胞損傷中具有保護作用。

識別靶基因?qū)沂緈iR-702-3p功能的分子機制具有重要意義。本研究表明,下調(diào)miR-702-3p后ALDH2蛋白表達相應(yīng)升高。ALDH2是一種抗凋亡酶[11],據(jù)報道,ALDH2廣泛表達于心臟,對心肌I/R損傷具有心臟保護作用[11,19]。在本研究中,H/R處理的心肌細胞ALDH2表達下降,與先前的結(jié)果一致。降低miR-702-3p表達時ALDH2表達升高,并且可以顯著減弱H/R誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡,提高細胞活力。此外,雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示,ALDH2是miR-702-3p的靶基因。這更證實了我們的想法。然而,本實驗的缺陷在于,需要進一步進行回復(fù)實驗,來驗證miR-702-3p降表達后同時降表達ALDH2,能否逆轉(zhuǎn)miR-702-3p的心肌保護作用。我們將在后續(xù)實驗中進行驗證。

總之,本研究表明,ALDH2是miR-702-3p的靶基因,降低miR-702-3p后ALDH2表達升高,心肌細胞凋亡率降低。因此,調(diào)控miR-702-3p表達可以在一定程度上為缺血再灌注損傷提供治療策略。