付 彩,崔小芳,裴香萍,杜晨暉,閆 艷*

(1 山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心,太原 030006;2 山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院;*通訊作者,E-mail:yanyan520@sxu.edu.cn)

酸棗葉(ZiziphiSpinosaeFolium)為鼠李科棗屬植物酸棗(ZiziphusjujubaMill. Var.spinosa(Bunge) Hu ex H. F. Chou)的干燥葉。始載于《本草綱目》,又名棘葉,具有“斂瘡解毒,治脛臁瘡”之功效[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明,酸棗葉具有明顯的鎮(zhèn)靜安神[2]、抗氧化[3]、保護(hù)肝臟[4]等多種保健功效?；瘜W(xué)成分研究表明酸棗葉中含有豐富的黃酮[5]、皂苷[6]、氨基酸[7]、核苷[8]、微量元素[9]等營養(yǎng)成分。課題組前期采用紫外分光光度法測定山西省9個不同產(chǎn)地的酸棗葉樣品中總黃酮的含量,發(fā)現(xiàn)山西晉中地區(qū)酸棗葉總黃酮含量最高且可達(dá)8%[5];采用超高效液相色譜-軌道阱高分辨質(zhì)譜(UHPLC-Q-Exactive)與高效液相色譜-化學(xué)發(fā)光(HPLC-CL)技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)酸棗葉中多以槲皮素和山奈酚為母核的黃酮為主,且能在線清除過氧化氫和超氧陰離子自由基[10]。為此我們優(yōu)化了酸棗葉總黃酮的提取純化工藝,富集了純度為41.5%的總黃酮部位[11]。為了對提取純化的酸棗葉總黃酮進(jìn)行質(zhì)量控制,本文將建立一種靈敏、高效、準(zhǔn)確度高的含量測定方法。

超高效液相色譜-四極桿/線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-QTRAP-MS)技術(shù)是研究中藥復(fù)雜成分的一種有效、可行的分析方法。傳統(tǒng)的多反應(yīng)監(jiān)測掃描(mmultiple reaction monitoring,MRM)是定量分析的“金標(biāo)準(zhǔn)”;而線性離子阱的增強子離子掃描模式(enhanced product ion scanning,EPI)可獲得相應(yīng)的二級碎片,在化合物定量的同時起到定性的作用[12]?；跀?shù)據(jù)依賴性獲取(information dependent acquisition,IDA)時,可實現(xiàn)多反應(yīng)監(jiān)測-觸發(fā)增強子離子掃描(MRM-IDA-EPI),實現(xiàn)一次進(jìn)樣同時獲得高靈敏度MRM的定量數(shù)據(jù)和二級全掃描質(zhì)譜圖進(jìn)行定性確認(rèn)。在不降低定性和定量分析性能的同時,既能實現(xiàn)高靈敏地定性鑒定化合物,又能在一次運行中準(zhǔn)確定量特定目標(biāo)化合物[13-15]。

本實驗采用基于MRM-IDA-EPI模式的液質(zhì)聯(lián)用方法(LC-MS/MS)對酸棗葉總黃酮中蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-洋槐糖苷、槲皮素6種化學(xué)成分進(jìn)行鑒定,同時對以上化合物進(jìn)行含量測定,為后期藥效學(xué)及藥動學(xué)研究提供實驗基礎(chǔ),同時將為酸棗葉總黃酮的開發(fā)利用提供合理的科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent1290Ⅱ超高效液相色譜儀,配有G7120A四元泵,G7116B柱溫箱,G7167B自動進(jìn)樣器(美國Agilent公司);3200 QTRAP三重四級桿線性離子阱質(zhì)譜儀,配有ESI離子源,Analyst 1.5.2 software數(shù)據(jù)系統(tǒng)(美國AB SCIEX公司);Neofuge13R高速冷凍離心機(中國力康公司);CPA225D型十萬分之一分析天平(德國Sartorius公司);Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

對照品槲皮素-3-O-洋槐糖苷(批號:20161227)、蘆丁(批號C1424058)、金絲桃苷(批號:20161022)、槲皮素-3-O-葡萄糖苷(批號:HI105405198)、槲皮苷(批號:20160830)均購自寶雞辰光生物科技有限公司。槲皮素(批號:Q111274)購自阿拉丁試劑有限公司。經(jīng)HPLC歸一化法測定對照品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98%。甲醇、乙腈和甲酸為色譜純,購自美國Thermo Fisher公司。超純水由Milli-Q制備,其余試劑均為分析純。

酸棗葉2017年10月采自山西省晉中市(樣品編號:20170627004),經(jīng)山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室杜晨暉副教授鑒定為鼠李科植物酸棗ZiziphusjujubeMill. var.spinosa(Bunge) Huex H. F.Chou的干燥葉子。留樣于山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心。酸棗葉經(jīng)AB-8型大孔樹脂純化得總黃酮部位,得率為10%,純度為41.5%。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為ACQUITY UPLC?HSS T3(150 mm×2.1 mm,1.8 μm);流動相為乙腈(A)-水(B)(含有0.1%甲酸);梯度洗脫條件:0-5 min 15%A,5-13 min 15%-16%A,13-17 min 16%A,17-20 min 16%-16.5%A,20-24 min 16.5%-100%A;流速為0.3 ml/min;柱溫35 ℃;進(jìn)樣量2 μl。對照品和樣品的MRM色譜圖見圖1。

左邊一列為對照品,右邊為酸棗葉總黃酮樣品;1.槲皮素-3-O-洋槐糖苷;2.蘆丁;3.金絲桃苷;4.槲皮素-3-O-葡萄糖苷;5.槲皮苷;6.槲皮素圖1 對照品和酸棗葉總黃酮樣品的MRM色譜圖Figure 1 The representative MRM chromatograms of standard solution and Ziziphi Spinosae Folium sample

2.2 質(zhì)譜條件

離子源:電噴霧離子源(ESI);掃描模式:MRM負(fù)離子掃描;源噴射電壓(IS)為-4 500 V;霧化溫度:550 ℃;氣簾氣(Curtain gas,N2):40.0 psi;霧化氣(GS1,N2):50 psi;輔助氣(GS2,N2):50 psi。全掃面模式下針泵進(jìn)樣6種指標(biāo)成分對照品質(zhì)譜參數(shù)見表1,從中選擇出的6個定量離子見表2。

表1 全掃面模式下針泵進(jìn)樣6種成分的離子碎片Table 1 Full-scan model and the proposed fragmentation schemes of six components

表2 6種成分的保留時間和質(zhì)譜分析參數(shù)Table 2 Retention time and MS parameters of the six components

MRM-IDA-EPI模式:IDA參數(shù),select 1 to 1 most intense peaks;選擇動態(tài)背景扣除(alter dynamic background subtraction of survey scan);閾值(which exceeds),500 cps。

EPI參數(shù)設(shè)置為掃描范圍:50-650;掃描速率(scan rate):1 000 Da/s;離子阱動態(tài)填充(dynamic fill time);DP:-80 eV;EP:-10 eV;CES:(-45±15)eV。

2.3 溶液的制備

2.3.1 對照品溶液的制備 取對照品適量,精密稱定,加70%的甲醇制備成槲皮素-3-O-洋槐糖苷和蘆丁濃度為1 mg/ml的單一對照品儲備液,加70%的甲醇制備成金絲桃苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮苷和槲皮素濃度均為0.02 mg/ml的單一對照品溶液。分別精密吸取上述對照品儲備液,適量加甲醇制成濃度分別為50,52.8,0.544,1.034,1.014,0.148 μg/ml的混合對照品儲備液。

2.3.2 供試品溶液的制備 稱取酸棗葉總黃酮粉末約10 mg,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加70%甲醇25 ml,稱定質(zhì)量,超聲提取20 min。放置室溫,再稱定質(zhì)量,用70%甲醇補足減失質(zhì)量,0.45 μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,即得。

2.4 定性分析

按“2.1”和“2.2”項下色譜和質(zhì)譜條件,分別對樣品中6個化合物進(jìn)行EPI參數(shù)的優(yōu)化,獲得高質(zhì)量的二級碎片信息(見圖2)。以蘆丁為例,參考文獻(xiàn)[16]發(fā)現(xiàn),在負(fù)離子模式下,丟失蕓香糖形成特征離子碎片301,碎片301繼續(xù)裂解形成碎片273.0,255.1,179.0,151.0等。通過與對照品針泵進(jìn)樣離子碎片和文獻(xiàn)[10]比較,其他5個化合物分別被鑒定為:槲皮素-3-O-洋槐糖苷、金絲桃苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮苷、槲皮素。

圖2 MRM-IDA-EPI模式下酸棗葉總黃酮6種化合物的EPI圖譜Figure 2 EPI spectra for six components in Ziziphi Spinosae Folium based on MRM-IDA-EPI mode

由此可見,MRM-IDA-EPI模式與常見的三重四級桿掃描模式相比,增強了二級碎片離子掃描,使定性、定量分析更準(zhǔn)確。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系、定量限和檢測限 精密量取上述混合對照品溶液適量,用70%甲醇逐級稀釋7個濃度梯度的混合對照品溶液。按“2.1”“2.2”項下色譜和質(zhì)譜條件分析,以指標(biāo)成分的峰面積為縱坐標(biāo)(Y),質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),進(jìn)行線性回歸,得回歸方程、相關(guān)系數(shù)(r)和線性范圍,結(jié)果6種指標(biāo)成分的質(zhì)量濃度和峰面積的相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.999 5,表明該方法線性關(guān)系良好。將混合對照品溶液按照質(zhì)量濃度梯度由高到低稀釋,分別以信噪比S/N=10和S/N=3時各對照品的量作為定量限(LOD)和檢測限(LOD),結(jié)果見表3。

表3 6種成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、LOQ和LODTable 3 Regression equations, correlation coefficients and linearity ranges of the six components

2.5.2 精密度試驗 精密吸取同一混合對照品溶液,按“2.1”“2.2”項下色譜和質(zhì)譜條件同一天內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄6種指標(biāo)成分的峰面積,并計算其峰面積的RSD值。連續(xù)3 d,每天精密吸取上述混合對照品溶液,按“2.1”“2.2”項下色譜和質(zhì)譜條件同一天內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣3次,記錄6種指標(biāo)成分3 d的峰面積,并計算其峰面積的RSD值。結(jié)果顯示,6個化合物的RSD值均小于3%(見表4),表明儀器的日間精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗 取同一批酸棗葉總黃酮粉末樣品,約10 mg,精密稱定,按“2.3”項下方法制備供試品溶液,于室溫放置0,2,4,6,12,24 h后按“2.1”“2.2”項下色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析,以峰面積為指標(biāo)進(jìn)行分析,計算6種指標(biāo)成分峰面積的RSD值,結(jié)果顯示,6個化合物的RSD值均小于3%(見表4),表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.4 重復(fù)性試驗 取同一批酸棗葉總黃酮樣品粉末6份,每份約10 mg,精密稱定,按“2.3”項下方法制備供試品溶液,按“2.1”“2.2”項下色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析,分別記錄6種指標(biāo)成分的峰面積,計算其質(zhì)量分?jǐn)?shù)及其RSD值。6份樣品中槲皮素-3-O-洋槐糖苷、蘆丁、金絲桃苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮苷、槲皮素的含量依次為10.4%,8.3%,0.1%,0.3%,0.2%,0.005%,其RSD見表4,符合藥典規(guī)定要求,表明樣品提取方法的精密度良好。

表4 6種成分的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性Table 4 Stability, precision and repeatability of the six components

2.5.5 加樣回收率試驗 取已知6個成分含量的酸棗葉總黃酮樣品6份,每份約5 mg,精密稱定,置于具塞錐形瓶中,分別精密加入相當(dāng)于5 mg樣品中6種成分含量50%、100%、150%的混合對照品溶液,按“2.3”項下方法制備供試品溶液,按“2.1”“2.2”項下色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析,記錄指標(biāo)成分的峰面積,計算其平均加樣回收率及相應(yīng)的RSD值。由表5可知,6種化合物的回收率在99%-108%的范圍內(nèi),且RSD值均小于3%,表明提取方法的準(zhǔn)確度良好。

表5 6種成分的加樣回收率Table 5 Recovery of the six components

2.5.6 樣品測定 分別取待測的酸棗葉總黃酮樣品3份,每份約10 mg,精密稱定,按“2.3”項下方法制備供試品溶液,按“2.1”“2.2”項下色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析,記錄指標(biāo)成分的峰面積,計算6種指標(biāo)成分的含量。3份樣品中,槲皮素-3-O-洋槐糖苷、蘆丁、金絲桃苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮苷、槲皮素的平均含量分別為10.4%,8.3%,0.1%,0.3%,0.2%,0.005%(相當(dāng)于酸棗葉總黃酮質(zhì)量)。

3 討論

本文建立了一種基于MRM-IDA-EPI模式的液質(zhì)聯(lián)用方法同時測定酸棗葉總黃酮含量的方法,并采用數(shù)據(jù)依賴掃描模式獲得每個化合物的二級質(zhì)譜信息,對化合物進(jìn)行鑒別表征?，F(xiàn)有的液質(zhì)聯(lián)用檢測方法多采用多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)掃描方式進(jìn)行定性與定量檢測,MRM檢測靈敏度高、定量準(zhǔn)確,但在定性的準(zhǔn)確程度上依靠兩離子對的豐度比進(jìn)行最終確認(rèn)不夠嚴(yán)謹(jǐn),檢測中易出現(xiàn)假陽性峰干擾判斷[17]。本文采用在MRM掃描方式下進(jìn)一步聯(lián)合EPI掃描可以在較低濃度條件下生成二級子離子全掃描圖,同時定性定量分析。

酸棗葉總黃酮中含有大量的同分異構(gòu)體,色譜條件直接影響到被分析化合物的分離效能。首先對流動相組成進(jìn)行考察,在水相中分別加入0.1%和1%的甲酸,結(jié)果表明流動相中含有0.1%的甲酸時色譜峰的離子響應(yīng)最大。此外,分別比較了ACQUITY UPLC?BEH C18,Atlantis?T3及ACQUITY UPLC?HSS T3色譜柱,結(jié)果表明ACQUITY UPLC?HSS T3色譜柱對黃酮類成分的分離效果最好。

本實驗針泵進(jìn)樣優(yōu)化MRM條件,分別對6個化合物的去簇電壓(DP)和碰撞能量(CE)進(jìn)行優(yōu)化,得到6個母離子和子離子離子對。當(dāng)MRM信號低于IDA設(shè)定的閾值500 cps時,只進(jìn)行MRM掃描;當(dāng)MRM信號大于IDA設(shè)定的閾值500 cps時同時啟動線性離子阱的EPI功能。為了得到豐富的二級碎片信息,繼而對EPI參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果表明,當(dāng)EPI中DP為80、CES為(40±15)eV時,6個化合物的碎片離子最豐富。含量測定結(jié)果表明,槲皮素-3-O-洋槐糖苷與蘆丁這一對同分異構(gòu)體為酸棗葉總黃酮的主要成分,兩者的含量占總黃酮的19.35%。槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮苷、金絲桃苷的含量相對較低,均小于0.3%,而槲皮素的含量最低為0.005%。由此可見,酸棗葉總黃酮以糖苷類成分為主,而這6種糖苷類成分均具有較強的抗氧化活性[18]。值得注意的是有報道研究槲皮素糖苷類化合物如槲皮苷等對H2O2和紫外(UV)損傷造成的人胚皮膚成纖維細(xì)胞(ESF-1)細(xì)胞衰老具有良好的保護(hù)作用[19]。而且在本次實驗中含量高的蘆丁也被報道可以通過抗氧化機制延緩D-半乳糖造成的大鼠的氧化衰老[20]。

基于以上分析,提示酸棗葉總黃酮可能具有延緩衰老的作用,有待進(jìn)一步研究。酸棗葉總黃酮有望成為一種新型綠色的、可持續(xù)的抗氧化資源;有望開發(fā)為具有抗氧化、抗衰老功能的健康產(chǎn)品。同時本研究為后期的藥效學(xué)及藥動學(xué)研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)和質(zhì)量保證。