孫國榮，馬少鴻，韋光本，張依琳，譚慧明，蔡雙虎

（廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院/廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟動物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點實驗室，廣東 湛江 524088）

【研究意義】哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）是一種彎曲桿狀、有發(fā)光特性、耐鹽的革蘭氏陰性菌，是海水生物中的正常成員［1］。但隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，哈維氏弧菌被認(rèn)為是海水養(yǎng)殖動物的重要病原菌，主要感染對象是凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）［2］、太平洋牡蠣（Crassostrea gigas）［3］、斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）［4］、金鯧（Trachinotus ovatus）［5］和大菱鲆（Psetta maxima）［6］等。徐芝亮等［7］發(fā)現(xiàn)感染的對蝦主要癥狀表現(xiàn)為體表變暗、運動遲緩、發(fā)光甚至死亡等；Saulnier等［8］就法國太平洋牡蠣大批死亡事件進行研究，發(fā)現(xiàn)與哈維氏弧菌密切相關(guān)；吳后波等［9］針對海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖的高體鰤弧菌病進行研究，發(fā)現(xiàn)患病魚表現(xiàn)為消瘦，體表潰爛、脫鱗，肝、脾等內(nèi)臟出現(xiàn)明顯病變；Alvarez等［10］發(fā)現(xiàn)哈維氏弧菌感染的大西洋棘白鯧（Chaetodi pterus faber）表現(xiàn)為眼球突出、鰭充血；范文輝等［6］研究發(fā)現(xiàn)患病大菱鲆主要表現(xiàn)為身體表面潰爛，鰓絲貧血，內(nèi)臟腫大，腸透明?？梢?，海水養(yǎng)殖魚感染哈維氏弧菌的發(fā)病癥狀因魚的種類及生存環(huán)境不同各有差別，但均會給海水養(yǎng)殖戶造成巨大損失。目前生產(chǎn)上多數(shù)依靠使用抗生素減少病害，但濫用抗生素不僅會導(dǎo)致耐藥性菌株不斷出現(xiàn)［11］，而且藥物殘留極大影響水產(chǎn)品的質(zhì)量，還會污染水體破壞生態(tài)平衡。近年來隨著免疫學(xué)和基因工程的快速發(fā)展，新型疫苗的研制備受關(guān)注。【前人研究進展】編碼絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶（serine hydroxylmethyltransferase,SHMT）的glyA基因在細菌中不可或缺，研究表明，該蛋白催化絲氨酸、甘氨酸相互轉(zhuǎn)化為菌體，提供充足的氨基酸［12］。而L-絲氨酸對細菌的作用非常多，如分子結(jié)構(gòu)中的甲基可滿足機體對一碳單位（如甲基、甲?；皝啺奔谆龋┑男枨?；能參與S-腺苷甲硫氨酸、嘧啶、嘌呤等小分子物質(zhì)的生物合成，進而合成核酸、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)；能轉(zhuǎn)變成乙醇胺、膽堿，用于合成磷酸脂；能轉(zhuǎn)變?yōu)橐阴Ｄ憠A，對神經(jīng)系統(tǒng)有關(guān)鍵作用［14］?？梢?，該基因?qū)毦膹?fù)制、信息傳遞具有重要影響。國內(nèi)外已有學(xué)者對不同生物的SHMT蛋白展開研究，如擬南芥［15］、嗜水氣單胞菌［16］、脊尾白蝦［17］、家蠶［18］，但針對弧菌的研究很少。【本研究切入點】以克隆哈維氏弧菌glyA基因全長為基礎(chǔ)，設(shè)計構(gòu)建哈維氏弧菌原核表達載體BL21-pET-28a-glyA，并對重組菌株誘導(dǎo)表達條件進行優(yōu)化。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究成功構(gòu)建了BL21-pET-28a-glyA重組菌株，并獲得最佳誘導(dǎo)表達條件，以期為亞單位疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試哈維氏弧菌ZJ0603菌株篩選自患病斜帶石斑魚（Epinephelus coioides），Takara pMD-18T、pET-28a、大腸桿菌感受態(tài)（Escherichia coli）DH5α和BL21均由廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟動物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點實驗室提供。Easy Pure PCR Purification Kit試劑盒和Easy Pure Plasmid Mini Prep Kit試劑盒購自賽默飛世爾科技公司；耐超高溫DNA聚合酶、BamHⅠ和XhoⅠ內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶購自Takara公司；氨芐霉素、卡那霉素、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）購自上海生物工程公司。

1.2 試驗方法

1.2.1glyA基因克隆 將超低溫下保存的哈維氏弧菌ZJ0603菌株接種于培養(yǎng)基進行擴繁，然后根據(jù)說明書提示提取哈維氏弧菌ZJ0603菌株的全基因組。根據(jù)GenBank已公布的弧菌glyA（登錄號：MT364338）基因序列，分別設(shè)計含BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點的上下游引物，上游引物F：（含BamHⅠ酶切位點）5'-CGCGGATCCATGAACAA GAGTTACCCTA-3'，下游引物（含XhoI酶切位點）R:5'-CCGCTCGAGTTATTGGTAAAGAGGGTA-3'，下劃線部分為酶切位點及保護堿基以確保不發(fā)生堿基錯配。以提取的哈維氏弧菌全基因組為模板特異性擴增獲得glyA基因，PCR反應(yīng)體系50 μL，含TaqDNA 聚合酶 25 μL、無菌水 21 μL、DNA模板2 μL、上下游引物各1 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、58 ℃ 90 s、72 ℃ 1 min，35 個循環(huán)；72℃延伸10～15 min。

經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測目的片段大小后，參考說明書將PCR產(chǎn)物純化獲得glyA基因片段，與pMD-18T載體在4 ℃條件下連接過夜（16 ℃2 h），然后轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α，在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng) 1 h（37 ℃ 180 r/min），取 100～150 μL涂布于含100 μg/mL氨芐霉素的平板上繼續(xù)培養(yǎng)過夜后，挑取單菌落進行菌落PCR，電泳檢測片段正確后送由廣州生工生物工程公司進行測序。

1.2.2 載體pET28a-glyA的構(gòu)建 參照試劑盒說明書分別對經(jīng)測序的重組質(zhì)粒pMD-18T-glyA和空載pET-28a提取質(zhì)粒，經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ酶切后，借助T4連接酶的特性將兩者連接起來即可成功構(gòu)建pET-28a-glyA，然后轉(zhuǎn)入E. coliBL21中，過夜培養(yǎng)后進行菌落PCR鑒定，將片段大小符合的菌液（?。?00 μL）送至廣州生工生物工程公司進行測序。

1.2.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達 37 ℃、180 r/min條件下，重組菌株BL21-pET-28a-glyA在含100 μg/mL卡那霉素LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每隔30 min測1次OD600值。當(dāng)OD600達0.4～0.6時，抽取1 mL未經(jīng)誘導(dǎo)的BL21-pET-28a-glyA為對照，同時向培養(yǎng)基中添加1 mmol/L IPTG進行誘導(dǎo)表達。對照組與試驗組同時在37 ℃下振動培養(yǎng)4 h后離心，PBS洗凈后10～15 min水煮提取蛋白，取10 μL上清進行SDS-PAGE電泳分析以確保重組蛋白正常表達。

1.2.4 原核表達條件優(yōu)化 分別在不同IPTG濃度、時間、溫度條件下對重組菌株表達條件進行優(yōu)化。

（1）IPTG誘導(dǎo)濃度：設(shè)誘導(dǎo)劑IPTG梯度為 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L，在 37 ℃180 r/min下培養(yǎng)4 h，低速離心后經(jīng)PBS洗凈，用水煮法獲得蛋白后進行SDS-PAGE電泳分析。SDS-PAGE電泳條件：5%濃縮膠電壓設(shè)置為80～90 V，10%～12%分離膠電壓設(shè)置為100～120 V，每孔上樣約10～20 μL，電泳2～2.5 h。然后用考馬斯亮藍染色2 h，再用脫色液脫色［19］。

（2）誘導(dǎo)時間：其他處理條件不變情況下，分別在誘導(dǎo)0、1、2、3、4、5 h后收集菌液，用（1）的SDS-PAGE電泳方法進行分析（誘導(dǎo)時間達到后放于4 ℃冰箱，防止誘導(dǎo)劑繼續(xù)誘導(dǎo)影響試驗結(jié)果）。

（3）溫度：當(dāng)OD600值達到0.4～0.6時，分別在20 ℃、37 ℃，IPTG濃度為1 mmol/L條件下誘導(dǎo)4 h，離心收集10～20 mL菌液，并用PBS清洗吹勻，然后放置于冰上進行超聲破碎細胞壁（功率300 W，超聲開時間2 s，超聲關(guān)時間8 s，超聲破碎總時間約10 min）至菌液澄清透明時即停止（若破碎中有黑色沉淀，說明超聲時間過長，蛋白變性，應(yīng)縮短超聲時間）。低溫離心后將裂解液的上清和沉淀分裝，上清保存于4 ℃冰箱，沉淀用8 mol/L尿素在4 ℃條件下溶解過夜［20］。用（1）的SDS-PAGE電泳方法進行分析。

1.2.5 Western Blot分析 在最佳表達條件下誘導(dǎo)處理重組菌株，利用pET-28a序列上的His標(biāo)簽特異吸附SHMT特異性純化融合蛋白，蛋白在低溫、200 mA條件下進行電泳2～2.5 h，然后將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，放在封閉液（5%脫脂奶粉）中4 ℃過夜（常溫搖床2 h）處理，用TTBS溶液沖洗，10 min/次，重復(fù)4次（或5 min/次，重復(fù)5次，），加一抗：鼠抗His-Tag單克隆抗體（體積比1∶5000稀釋），常溫搖床孵育；如上TTBS沖洗，加二抗：HRP-Tag山羊抗鼠IgG（1∶5000）孵育，TTBS沖洗后使用顯色液顯色，待條帶肉眼可見后滴加ddH2O結(jié)束反應(yīng)。

1.2.6 生物信息學(xué)分析 利用NCBI ORF finder獲得glyA編碼的氨基酸序列，Expasy-Prot分析SHMT蛋白的理化性質(zhì)，SignalP5.0 Server預(yù)測SHMT蛋白的信號肽，Psort.hgc預(yù)測蛋白亞細胞定位；MEGA10.0和DNAMAN9.0分析序列同源性，SOPMA對其高級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測；SOPMA分析序列二級結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 glyA基因擴增及生物信息學(xué)分析

PCR擴增后獲得如圖1的條帶，大小與預(yù)測的glyAORF大小一致。經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，哈維氏弧菌glyA基因ORF為1 296 bp，編碼431個氨基酸，編碼的SHMT蛋白理論分子質(zhì)量為46.60 ku，理論等電點6.18，不穩(wěn)定系數(shù)28.66（＜40，蛋白穩(wěn)定），脂肪系數(shù)88.33，總平均親水性-0.200（親水性蛋白）。該蛋白位于細胞質(zhì)中，N端無信號肽切割位點，序列中含有N-糖基化位點3個，蛋白激酶C磷酸化位點6個，酪氨酸激酶磷酸化位點1個，N-肉豆蔻酰化位點13個，酰胺化位點1個，C端靶向信號11個，絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶吡哆醛-磷酸附著基1個，脂蛋白標(biāo)簽1個。通過BLAST對哈維氏弧菌glyA氨基酸序列進行同源性分析，發(fā)現(xiàn)哈維氏弧菌與日本弧菌、歐文斯氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌glyA基因同源性較高，其中與日本弧菌屬同源性最高、達99.54%。從二級結(jié)構(gòu)來看，哈維氏弧菌α-螺旋占比45.71%，β-轉(zhuǎn)角占比6.96%，延伸鏈占比13.23%，隨機線圈占比34.11%。

圖1 glyA 基因PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig. 1 Electrophoresis result of PCR products of glyA

2.2 重組表達載體pET28a-glyA的誘導(dǎo)表達及條件優(yōu)化

將重組質(zhì)粒pET-28a-glyA連接后轉(zhuǎn)入表達菌株BL21，測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)構(gòu)建的pET-28a-glyA沒有發(fā)生突變及錯配，表明表達載體BL21-pET-28a-glyA構(gòu)建成功。經(jīng)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)過的重組載體pET-28a-glyA出現(xiàn)約為46.6 ku的明顯蛋白條帶，以上結(jié)果說明glyA基因在表達載體中成功表達。

2.2.1 不同IPTG 濃度對重組蛋白表達的影響分析不同濃度IPTG誘導(dǎo)重組蛋白，結(jié)果（圖2）表明，誘導(dǎo)前的全菌蛋白沒有目的條帶，0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)后均有目的蛋白出現(xiàn)，以0.4 mmol/LIPTG誘導(dǎo)的蛋白表達量達到最高，因此IPTG最佳誘導(dǎo)濃度為0.4 mmol/L。

圖2 不同IPTG 濃度對重組蛋白表達的影響Fig. 2 Effects of different IPTG concentrations on recombinant protein expression

2.2.2 不同誘導(dǎo)時間對重組蛋白表達的影響 不同誘導(dǎo)時間結(jié)果（圖3）表明，IPTG誘導(dǎo)濃度為0.4 mol/L且其他條件相同時，時間的變化重組蛋白表達量隨誘導(dǎo)時間變化呈先增加后穩(wěn)定趨勢，誘導(dǎo)4 h時重組蛋白表達量達到最大，故最佳誘導(dǎo)時間為4 h。

圖3 不同誘導(dǎo)時間對重組蛋白表達的影響Fig. 3 Effect of induction time on recombinant protein expression

2.2.3 不同溫度對重組蛋白表達的影響 由圖4可見，重組菌株在20 ℃和37 ℃條件下誘導(dǎo)表達，上清和沉淀中均有目的蛋白出現(xiàn)，且上清的表達量均高于沉淀，以37 ℃時上清的蛋白表達量最高。

圖4 不同溫度對重組蛋白表達的影響Fig. 4 Effect of different temperature on recombinant protein expression

2.3 Western blot分析

圖5 Western blot 鑒定結(jié)果Fig. 5 Result of Western blot identification

在37 ℃、0.4 mmol/L IPTG條件下對重組菌株進行誘導(dǎo)表達4 h，然后對其細胞壁破碎并收集上清進行純化。Western blot分析結(jié)果（圖5）表明，經(jīng)誘導(dǎo)的重組菌株出現(xiàn)符合預(yù)測值的目的條帶，而未誘導(dǎo)的重組菌株無條帶出現(xiàn)，說明SHMT蛋白表達成功。

3 討論

目前生產(chǎn)上對哈維氏弧菌引起的病害多采用抗生素措施預(yù)防暴發(fā)，但會造成環(huán)境和食品抗生素殘留以及耐藥細菌的產(chǎn)生，引發(fā)各界人士擔(dān)憂［21］。隨著分子免疫學(xué)和基因工程等新型技術(shù)的快速發(fā)展，近年來出現(xiàn)了亞單位疫苗（Subunit vaccine）［22］，又稱重組亞單位疫苗。利用DNA重組，將致病菌某些抗原基因?qū)胧荏w，使其在受體中快速表達，再將保護性抗原與其他適宜的試劑配合即可制成基因工程亞單位疫苗［23］。亞單位疫苗具有穩(wěn)定性好、免疫效果好、免疫時效長等優(yōu)點。因此，確定病原體主要保護性抗原并合成毒副作用低的亞單位疫苗逐漸受到人們關(guān)注。

本研究克隆了glyA基因，將其序列與大腸桿菌的絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶基因進行比對，發(fā)現(xiàn)序列同源性為58.59%，氨基酸序列同源性為56.81%，同源性較低；且從二級結(jié)構(gòu)來看，哈維氏弧菌α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈、隨機線圈占比分別為45.71%、6.96%、13.23%、34.11%，而大腸桿菌中α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈、隨機線圈占比分別為46.28%、7.91%、14.63%、31.18%，這些序列上的差異可能有助于哈氏弧菌在海水中存活。

為獲得哈維氏弧菌的SHMT蛋白，本研究擴增了哈維氏弧菌glyA基因，得到長為1 296 bp的序列，并將其在大腸桿菌pET28-BL21表達系統(tǒng)里表達，該載體含有噬菌體T7強啟動子，可在含有T7噬菌體的BL21菌株中短時間內(nèi)提高SHMT外源蛋白表達量；且pET28載體帶有6×His-Tag標(biāo)簽，使得蛋白純度更高，更利于提高后續(xù)SDSPAGE、Western blot檢測的準(zhǔn)確度［24-26］；BL21是一株常見的大腸桿菌菌株，能夠在最低限度的培養(yǎng)基中旺盛生長，不致病，也不大可能在宿主組織中存活并導(dǎo)致疾?。?7］。

外源基因在大腸桿菌中表達的影響因素很多，主要包括不可控因素和可控因素，如外源基因、載體和宿主菌的結(jié)構(gòu)為不可控因素，培養(yǎng)環(huán)境、營養(yǎng)狀況、誘導(dǎo)濃度等為可控因素。因此，必須對其可控因素進行優(yōu)化才能獲得最大程度的表達［28］。

4 結(jié)論

本研究克隆出哈維氏弧菌中一段長為1 296 bp的glyA基因，與pET-28a連接并轉(zhuǎn)入BL21中，成功構(gòu)建BL21-pET-28a-glyA重組質(zhì)粒。IPTG誘導(dǎo)后Western blot分析結(jié)果表明成功獲得SHMT重組蛋白，對表達條件優(yōu)化后發(fā)現(xiàn)，IPTG最佳誘導(dǎo)濃度、時間以及溫度分別為0.4 mmol/L、4 h、37 ℃，研究結(jié)果為下一步研制亞單位疫苗奠定基礎(chǔ)。