衡 周，孫小晴,2，黃俊霖，孫保娟，李植良，李 穎，李 濤

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所/廣東省蔬菜新技術(shù)重點實驗室，廣東 廣州 510640；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430070）

【研究意義】茄褐紋擬莖點霉（Phomopsis vexansHarter）是真菌界半知菌類腔孢綱球殼孢目球殼孢科擬莖點霉屬真菌，是造成茄子褐紋病的病原菌［1］。此病菌可造成茄子苗期猝倒，生長期葉片病斑、干枝、結(jié)果期果腐等癥狀，最終導(dǎo)致減產(chǎn)20%～70%［2-3］。目前針對茄子褐紋病的研究主要集中在菌株分離培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)及分子鑒定、基于離體接種的致病力鑒定等方面［2,4-12］。針對褐紋病菌致病分子機理的研究還十分有限。孢子萌發(fā)是致病菌侵染植株和完成生活史的關(guān)鍵步驟［13］。通過現(xiàn)代組學(xué)技術(shù)對孢子萌發(fā)過程中分子水平的變化進行研究有助于找到致病菌孢子萌發(fā)過程中的關(guān)鍵基因、蛋白，也有助于定位潛在抗菌劑靶點及致病菌效應(yīng)因子［14］。因此，孢子萌發(fā)機理研究是致病分子機理研究的重要組成部分。且已在水稻稻瘟?。?5］、大豆菌核?。?6］、香蕉枯萎?。?7］等病害的研究中得到有效應(yīng)用。針對孢子萌發(fā)機理的組學(xué)研究需要大量孢子作為實驗材料。因此，探索更高效的產(chǎn)孢方法對茄子褐紋病菌孢子萌發(fā)相關(guān)的組學(xué)研究有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】羅立娟等［18-19］通過改變固體培養(yǎng)基配方、增加光照、降低溫度，使菌落長出分生孢子器，再通過無菌水沖洗培養(yǎng)皿，從中獲取孢子，此方法最快需要5～6 d。鐘彩虹等［20］在此基礎(chǔ)上，通過對固體培養(yǎng)基上的菌絲進行掃刷、無菌水沖洗、晾干等步驟將固體培養(yǎng)基大量產(chǎn)孢時間縮短到4 d。Rohini等［21］使用PDA培養(yǎng)基在28 ℃培養(yǎng)7 d產(chǎn)孢。Mudasir等［22］分析了30個茄褐紋病菌株的菌絲形態(tài)及顏色,并發(fā)現(xiàn)不同菌株在PDA培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)需要的產(chǎn)孢時間從5 d到30 d不等?！颈狙芯壳腥朦c】隨著生物技術(shù)的發(fā)展，利用基因組、蛋白組、代謝組等多組學(xué)為致病機制研究提供了新的技術(shù)手段，然而以上傳統(tǒng)產(chǎn)孢方法所獲孢子數(shù)量有限且無法滿足多組學(xué)分析研究的需求?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以優(yōu)化培養(yǎng)方法和提高褐紋病菌產(chǎn)孢數(shù)量為主要科學(xué)問題，建立了茄子褐紋病致病菌的分離鑒定和產(chǎn)孢條件的優(yōu)化方法，為茄子抗褐紋病種質(zhì)資源篩選鑒定、抗病機制及褐紋病菌致病機理研究提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2019年3—12月在廣東省蔬菜新技術(shù)重點實驗室進行。褐紋病菌株（PV5）病株取自廣東省廣州市白云區(qū)鐘落潭鎮(zhèn)茄子種植基地（23°23' 24.5" N，113°26' 19.4" E）。

菌株及質(zhì)粒載體：TA克隆所用大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，pM-18T質(zhì)粒購自購自寶生物工程（大連）有限公司。

酶及有關(guān)試劑：Primer STAR 高保真PCR酶、Loading Buffer購自寶生物工程（大連）有限公司，瓊脂粉、葡萄糖購自Sigma公司，馬鈴薯、燕麥、苜蓿桿購自當?shù)厥袌觥?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 褐紋病菌株的分離純化 無菌環(huán)境下，取1×0.5 cm大小的病健交界處組織，無菌水沖洗2次后，次氯酸鈉溶液消毒10 min，無菌水沖洗3次后，放入PDA平板28 ℃培養(yǎng)。

1.2.2 褐紋病菌株的分子鑒定 取培養(yǎng)基中菌絲約100 mg，使用CTAB法提取真菌基因組DNA。以此DNA為模板，使用真菌核糖體rDNA區(qū)通用引物ITS1：ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'進行PCR反應(yīng)，擴增ITS1-5.8S-ITS2 rDNA全序列及部分18S和28S rDNA序列。反應(yīng)體系為：模板1 μL，上下游引物各 0.5 μL，ddH2O 8 μL，PCR 酶 MIX10 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 2 min，30 個循環(huán)；72 ℃ 10 min。對PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收DNA條帶，經(jīng)TA克隆后，送上海生工生物測序，將菌株ITS1-5.8S-ITS2 rDNA序列在NCBI網(wǎng)站上進行比對，下載比對結(jié)果中相似度較高序列，并使用MEGA軟件構(gòu)建進化樹。

1.2.3 培養(yǎng)基配制 馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基（Potato Dextrose Agar，PDA）的配制：去皮馬鈴薯200 g、瓊脂粉17～20 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1 000 mL，馬鈴薯洗凈后，稱取200 g，切成碎塊，放入鍋中加1 000 mL水煮沸30 min，雙層紗布過濾后，趁熱加17～20 g瓊脂粉和20 g葡萄糖使其充分溶解，補足水量，分裝到三角瓶并用封口膜密封，高壓濕熱滅菌（121 ℃，20 min）后冷卻備用。其他培養(yǎng)基方法相同，燕麥固體培養(yǎng)基（Oat Meal Agar，OMA）：燕麥30 g，瓊脂粉14 g，水1 000 mL。苜蓿煎汁固體培養(yǎng)基：苜蓿桿100 g，燕麥30 g，瓊脂粉14 g，水1 000 mL。對應(yīng)的液體培養(yǎng)基在配方中去除瓊脂粉。

1.2.4 液體培養(yǎng)基產(chǎn)孢方法 使用PDB, 50%（10 g）葡萄糖PDB，25%（5 g）葡萄糖PDB，無糖PDB，苜蓿煎汁液體培養(yǎng)基，燕麥液體培養(yǎng)基，接種后，在28 ℃150 r/min光照12 h/d條件下培養(yǎng)1 d后分別放入20、22、24、26 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.5 孢子的顯微鏡觀察 取液體培養(yǎng)基100 μL在干凈載玻片上，蓋上蓋玻片，顯微鏡觀察。產(chǎn)孢數(shù)量通過血球計數(shù)板顯微觀察測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 褐紋病菌的鑒定

2.1.1 形態(tài)學(xué)鑒定 從發(fā)病組織上分離得到菌株P(guān)V5，該菌株在PDA固體培養(yǎng)基上呈輻射狀生長，菌絲為白色絮狀。菌落整體呈同心輪紋狀，靠近菌落中心部位菌絲較密集，靠近菌落邊緣菌絲則相對稀疏（圖1 A）。生長后期菌落上產(chǎn)生黑色點狀分生孢子器，內(nèi)含大量孢子。光學(xué)顯微鏡觀察顯示孢子呈卵圓形，寬約5～6 μm，長約10～12 μm，兩端有油胞（圖1 B）。

圖1 茄子褐紋病菌菌落及孢子形態(tài)Fig. 1 Colonies and spore morphologies of Phomopsis vexans Harter

2.1.2 分子生物學(xué)鑒定 使用PV5菌株ITS1-5.8S-ITS2 rDNA區(qū)段在NCBI網(wǎng)站上進行序列相似性比對，發(fā)現(xiàn)該菌株的ITS序列與已報道的多條茄褐紋擬莖點霉菌序列相似度達80%以上。因此可以確定菌株為擬莖點霉屬的茄褐紋病菌。使用Neighbor-Joining法對菌株以及擬莖點霉屬其他種病原菌的ITS序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果（圖2）顯示，PV5與Phomopsis vexans親緣關(guān)系最近。從草莓上分離的Phomopsis obscuransd單獨聚為一分支，從葡萄、櫻桃和沙梨上分離的Phomopsis viticola、Phomopsis perniciosa和Phomopsis fukushii親緣關(guān)系與PV5較近。黃瓜和楊桃上分離的Diaporthe phaseolorum和Phomopsis averrhoae與PV5親緣關(guān)系較遠。

2.2 不同培養(yǎng)條件對產(chǎn)孢數(shù)量的影響

2.2.1 培養(yǎng)基形態(tài)對菌絲生長的影響 經(jīng)過24 h培養(yǎng)，PDA培養(yǎng)基和苜蓿煎汁+OMA培養(yǎng)基中菌斑直徑分別為1.5、1 cm，而OMA固體培養(yǎng)基中則未出現(xiàn)肉眼可見的菌落。液體培養(yǎng)基中部分菌絲由于搖床的搖動而呈小球狀，且3種液體培養(yǎng)基中的菌絲量遠遠大于固體培養(yǎng)基（圖3）。

2.2.2 充分營養(yǎng)生長對產(chǎn)孢數(shù)量的影響 茄褐紋擬莖點霉菌在液體培養(yǎng)條件下28 ℃培養(yǎng)1 d即可產(chǎn)生大量菌絲。一定的低溫條件能促進孢子產(chǎn)生，而低溫不利于菌絲生長。為了緩解這一矛盾，本試驗探索使用28℃培養(yǎng)1 d后再放入24 ℃培養(yǎng)產(chǎn)孢。為了證明效果，使用28 ℃培養(yǎng)1 d、24 ℃培養(yǎng)3 d的產(chǎn)孢量與24 ℃持續(xù)培養(yǎng)4 d的產(chǎn)孢量進行比對，結(jié)果（表1）表明，不提供充分營養(yǎng)生長的條件下，褐紋病菌培養(yǎng)3 d后才開始產(chǎn)孢，而提供1 d的營養(yǎng)生長時間，褐紋病菌培養(yǎng)2 d后就開始產(chǎn)孢并且培養(yǎng)4 d后的孢子數(shù)量為不提供營養(yǎng)生長的240倍。

圖2 基于ITS-5.8S rDNA 序列構(gòu)建的遺傳進化樹Fig. 2 An evolutionary tree based on ITS-5.8S rDNA sequence of Phomopsis vexans Harter

圖3 不同形態(tài)培養(yǎng)基中PV5菌株菌絲生長情況Fig. 3 Growth condition of PV5 in different media

2.2.3 培養(yǎng)溫度對產(chǎn)孢數(shù)量的影響 為了探索液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的最佳產(chǎn)孢溫度，設(shè)置20、22、24、26 ℃ 4個溫度梯度，經(jīng)過28 ℃培養(yǎng)1 d后，將菌液放入相應(yīng)的溫度培養(yǎng)3 d并通過血球計數(shù)板觀察每培養(yǎng)1 d后的孢子數(shù)量，結(jié)果見表2。22～26 ℃條件下菌株在培養(yǎng)3 d后觀察到產(chǎn)孢。培養(yǎng)4 d后觀察產(chǎn)孢量發(fā)現(xiàn)，24℃培養(yǎng)條件下孢子含量最高。因此可以判斷，24℃為最佳產(chǎn)孢培養(yǎng)溫度。

表1 不同培養(yǎng)步驟的產(chǎn)孢數(shù)量（個/毫升）Table 1 Spore production quantity under different culture methods（spores/mL）

2.2.4 培養(yǎng)基配方對產(chǎn)孢數(shù)量的影響 在已有的產(chǎn)孢相關(guān)研究中，不同培養(yǎng)基種類對產(chǎn)孢數(shù)量也有較大影響。且培養(yǎng)基中碳源含量也會影響產(chǎn)孢。針對這一情況，研究了相同培養(yǎng)條件下，PDB、減糖PDB培養(yǎng)基以及兩種較常見產(chǎn)孢培養(yǎng)基的產(chǎn)孢數(shù)量，結(jié)果見表3。25%葡萄糖PDB培養(yǎng)基和苜蓿培養(yǎng)基產(chǎn)孢效率相對較高?？紤]到培養(yǎng)基配制的簡便性，25%葡萄糖PDB培養(yǎng)基產(chǎn)孢效率最高。

3 討論

褐紋病是當前茄子生產(chǎn)上的重大病害，然而由于相關(guān)研究基礎(chǔ)薄弱，僅局限于病原菌的分離鑒定和抗病資源篩選等研究，且缺乏完備的產(chǎn)孢方法，嚴重阻礙了茄子褐紋病菌的致病機制研究和分子機理解析。微生物人工培養(yǎng)條件的篩選與優(yōu)化是開展相關(guān)機理研究的技術(shù)基礎(chǔ)［23-24］。通過培養(yǎng)條件的優(yōu)化、簡化技術(shù)流程，進而獲得致病菌孢子的富集，對于深入研究孢子發(fā)育、致病機理具有重要理論意義。前人研究發(fā)現(xiàn)能促進植物病原菌產(chǎn)孢的因素主要有營養(yǎng)控制、寄主組織誘導(dǎo)、光照、物理損傷等［25］，目前針對褐紋病菌的研究多用PDA固體培養(yǎng)基對病菌進行培養(yǎng)。Akhtar等［26］曾使用馬鈴薯葡萄糖液體（PDB）培養(yǎng)基對茄子褐紋病菌進行培養(yǎng)，并稱量了不同菌株的重量，但并未提及產(chǎn)孢相關(guān)內(nèi)容。本研究通過比較固體和液體培養(yǎng)基對菌絲生長量的影響，發(fā)現(xiàn)3種液體培養(yǎng)基（OMA培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、苜蓿煎汁+OMA）28 ℃培養(yǎng)1 d比固體培養(yǎng)基菌絲生長量增加。本研究通過6種液體培養(yǎng)基比較試驗發(fā)現(xiàn)，25%葡萄糖PDB培養(yǎng)基產(chǎn)孢效率最高；并且使用28 ℃培養(yǎng)1 d 24 ℃培養(yǎng)3 d后的產(chǎn)孢量是24 ℃持續(xù)液體培養(yǎng)4 d產(chǎn)孢量的240倍。因此，在促進菌絲生長后，可以根據(jù)實驗條件綜合多個因素如光照、機械損傷等以提高產(chǎn)孢效率。

表2 不同培養(yǎng)溫度的產(chǎn)孢數(shù)量（個/毫升）Table 2 Spore production quantity under different culture temperatures（spores/mL）

表3 不同培養(yǎng)基的產(chǎn)孢數(shù)量（個/毫升）Table 3 Spore production quantity under different culture media（spores/mL）

本研究在前人研究的基礎(chǔ)上，使用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)褐紋病菌，通過低溫光照提供的逆境，以及液體培養(yǎng)中搖床造成的機械力打斷菌絲，綜合了多種促進產(chǎn)孢的因素。同時，所產(chǎn)生分生孢子器中的孢子直接進入培養(yǎng)基，獲得的孢子液過濾后可直接使用，簡化了產(chǎn)孢過程。為茄子褐紋病菌的基因組及轉(zhuǎn)錄組研究［27］、深入挖掘茄褐紋病菌孢子萌發(fā)相關(guān)分子機制、開展褐紋病與植株的互作研究提供理論基礎(chǔ)。

本研究所產(chǎn)生的孢子均為α型孢子，未見β型孢子。在前人的研究中，PDA固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的褐紋病菌能產(chǎn)生α、β兩種孢子［13-14］，本課題組前期研究中也獲得了類似結(jié)果。但為何液體培養(yǎng)產(chǎn)孢只觀察到α型孢子，還需要進一步開展產(chǎn)孢機理研究。

4 結(jié)論

本研究首次嘗試使用液體培養(yǎng)基促進茄子褐紋病菌產(chǎn)孢。產(chǎn)孢條件的優(yōu)化結(jié)果表明，液體培養(yǎng)基中菌絲生長多余固體培養(yǎng)基且可用于產(chǎn)孢。最佳產(chǎn)孢條件為：在150 r/min搖床中，使用25%葡萄糖PDB培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)1 d后24℃培養(yǎng)3 d。在此條件下培養(yǎng)，產(chǎn)孢量可達到1.2×1010個 /mL。