李 娟，王文麗，趙 旭

（甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料與節(jié)水農(nóng)業(yè)研究所，甘肅 蘭州 730070）

【研究意義】當(dāng)歸（Angelica sinensis）為常用中藥材，屬中醫(yī)婦科用藥，是補(bǔ)血活血、去瘀生新、潤(rùn)腸通便、調(diào)經(jīng)止痛的良好藥物［1-2］。當(dāng)歸主產(chǎn)甘肅、陜西、云南和四川，有效成分為阿魏酸［3］、多糖、揮發(fā)油等，阿魏酸具有清除自由基的作用，能抑制血小板聚集和血栓形成［4］。甘肅當(dāng)歸產(chǎn)量最大、質(zhì)量最好，栽培歷史最為悠久［5］。甘肅當(dāng)歸正常年產(chǎn)量約1萬(wàn)t左右，占全國(guó)年產(chǎn)量95%以上，是當(dāng)?shù)刈罹邇?yōu)勢(shì)的特色藥材之一［6］。甘肅當(dāng)歸的主產(chǎn)區(qū)在岷縣，還有周邊的渭源縣、康樂(lè)縣、卓尼縣、宕昌縣。隨著當(dāng)歸需求量日益增加，大量種植造成連作面積不斷提高，多年連作導(dǎo)致當(dāng)歸生長(zhǎng)發(fā)育不良，產(chǎn)品品質(zhì)及產(chǎn)量下降，抗病能力降低，土壤環(huán)境逐年惡化，根病加重［7］。而導(dǎo)致土壤環(huán)境惡化的原因是連作使部分土壤養(yǎng)分異常積累，另一部分養(yǎng)分過(guò)度消耗，病原微生物迅速繁衍，土壤微生物種群結(jié)構(gòu)失調(diào)，引發(fā)作物品質(zhì)及產(chǎn)量下降［8-10］。有些生物有機(jī)肥所含的微生物對(duì)病菌有抑制作用?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】微生物菌劑和生物有機(jī)肥已應(yīng)用在多種作物上，施用生物有機(jī)肥（菌肥）可有效改善土壤性質(zhì)、提高土壤養(yǎng)分，通過(guò)增加根系活力、提高作物對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的吸收利用使作物增產(chǎn)或提高抗病性［11］。微生物菌劑和有機(jī)肥在當(dāng)今農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中越來(lái)越受重視，生物肥料在設(shè)施蔬菜［13］、馬鈴薯［14］、玉米［15］、水稻［16］、果樹(shù)［17］等多種作物上都有顯著增產(chǎn)效果，促進(jìn)作物對(duì)養(yǎng)分的吸收，增強(qiáng)作物的抗病性。用于生產(chǎn)生物肥料的菌種種類很多，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，已發(fā)現(xiàn)包括假單胞菌和芽胞桿菌等20多個(gè)屬的根圍細(xì)菌具有防病促生潛能［12］。但針對(duì)當(dāng)歸的專用抗病促生生物肥料較少?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】抗病型生物肥料DZF-363是由抗病菌株DG-16-2、DG-23復(fù)合而成。DG-16-2、DG-23是從當(dāng)歸根際分離的具有抑制鐮刀菌等病原微生物生長(zhǎng)的拮抗菌株，對(duì)當(dāng)歸有顯著促生效果?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】為探明生物肥料DZF-363的作用機(jī)理，進(jìn)行了生物肥料在當(dāng)歸上的盆栽試驗(yàn)，以期為肥料的推廣和當(dāng)歸安全生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

生物肥料DZF-363由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料與節(jié)水農(nóng)業(yè)研究所微生物研究室提供，含有機(jī)質(zhì)442 g/kg、全氮10.82 g/kg、全磷5.1 g/kg、全鉀12.3 g/kg、全鹽17.22 g/kg、pH7.5、兩種菌（壁芽孢桿菌Bacillus muralisDG-23和油菜假單胞菌PseudomonasbrassicacearumDG-16-2）的活菌數(shù)均≥2.5×108cfu/g。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)設(shè)施用載體10 g/盆、生物肥料DZF-363 10 g/盆和空白對(duì)照3個(gè)處理，每個(gè)處理8次重復(fù)。

試驗(yàn)在甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院溫室大棚進(jìn)行，采用塑料花盆，每盆裝土750 g、蛭石粉150 g。移栽前將土樣750 g與150 g蛭石粉、10 g生物肥料（或載體）充分混勻后裝盆。移栽前灌水按基質(zhì)重的35%計(jì)，即每盆灌水375 mL。每個(gè)處理裝盆10盆，當(dāng)歸每盆移栽2株，生長(zhǎng)30 d后每處理選擇長(zhǎng)勢(shì)良好的8盆作為重復(fù)，定植1株，生長(zhǎng)90 d后收獲，測(cè)定當(dāng)歸地上部、地下部鮮重和干重；取新鮮土壤過(guò)1 mm篩進(jìn)行土壤脲酶、磷酸酶活性及微生物群落多樣性測(cè)定。試驗(yàn)于2019年3月23日移栽，4月25日定苗，7月29日收獲。

當(dāng)歸植株的收獲及土樣取樣：將當(dāng)歸與土全部從花盆倒出，把周圍土抖落，將根上的土抖到牛皮紙上，植株裝入塑料袋中，土樣每?jī)膳杌旌暇鶆蜓b入1個(gè)自封袋中。將根沖洗干凈后用紙吸干水，進(jìn)行稱重；植株進(jìn)行株高、根長(zhǎng)、根粗測(cè)量，風(fēng)干后分別稱地上部和根干重。

土壤中可培養(yǎng)的微生物（細(xì)菌、真菌、放線菌）采用稀釋平板法測(cè)定；土壤脲酶活性測(cè)定采用靛酚比色法，磷酸酶活性測(cè)定采用磷酸苯二鈉比色法［18］。

土壤微生物群落碳代謝多樣性采用Biolog-MicroPlate方法進(jìn)行［19-20］：稱取10 g新鮮土壤加入裝有90 mL無(wú)菌生理鹽水錐形瓶中（0.85%NaCl溶液）。搖床振蕩30 min，靜置30 min，取上清液5 mL加入到45 mL無(wú)菌生理鹽水中，稍加振蕩后倒入V型接種槽，用八道移液器接種到Biolog Eco微平板，每個(gè)孔接種150 μL，25℃培養(yǎng)192 h，每24 h讀數(shù)1次，將OD值導(dǎo)出，用590 nm的OD值減去750 nmOD值的差值計(jì)算平均顏色變化率、豐富度等。

（1）平均顏色變化率（average well color development，AWCD），表示微生物群落的碳源代謝強(qiáng)度，是土壤微生物活性及功能多樣性的一個(gè)重要指標(biāo)［21-22］。采用各Eco-MicroPlate吸光值數(shù)據(jù)計(jì)算：

式中，Ci為除對(duì)照孔外各孔590 nm的OD值減去750 nm的OD值差，R為對(duì)照孔590 nm的OD值減去750 nm的OD值的差，n為31種碳源。

（2）Shannon-Wiener物種豐富度指數(shù)（H’），用于評(píng)估群落的物種豐富度：

式中，Pi為不同碳源的微孔和對(duì)照孔吸光值的差值與整個(gè)微板總體差值之和的比值：

式中，Ci為每個(gè)微板孔590 nm的OD值減去750 nm的OD值差，R為對(duì)照孔590 nm的OD值減去750 nm的OD值的差，n為31種碳源。

（3）McIntosh物種均一度指數(shù)（U）。

式中，ni為第i反應(yīng)孔與對(duì)照孔的差值（ni=Ci-R）。

（4）辛普森指數(shù)又稱優(yōu)勢(shì)度指數(shù)（D），是對(duì)多樣性方面的集中性度量。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2003進(jìn)行處理，采用DPS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物肥料對(duì)當(dāng)歸生長(zhǎng)的影響

表1結(jié)果顯示，施用生物肥料和載體處理對(duì)當(dāng)歸根生長(zhǎng)都有顯著促進(jìn)作用，尤其是對(duì)當(dāng)歸根干重、蘆頭直徑有顯著促進(jìn)作用。與對(duì)照相比，施用生物肥料后當(dāng)歸的根干重、蘆頭直徑分別增加100.5%、31.39%，施用載體處理當(dāng)歸的根干重、蘆頭直徑分別增加28.1%、10.31%，差異顯著。

表1 不同處理對(duì)當(dāng)歸生長(zhǎng)的影響Table 1 Effects of different treatments on the growth of A. sinensis

2.2 生物肥料對(duì)當(dāng)歸根際土壤微生物數(shù)量的影響

試驗(yàn)結(jié)果（表2）表明，在當(dāng)歸根際施用生物肥料可以顯著增加根際土壤細(xì)菌、真菌、防線菌數(shù)量。與對(duì)照相比，生物肥料處理細(xì)菌、真菌、放線菌分別增加154%、21.6%、34.7%，差異顯著，載體處理分別增加78%、20.1%、6.5%；生物肥料處理與載體處理相比，細(xì)菌、真菌、放線菌分別增加42.6%、1.27%、26.5%。說(shuō)明生物肥料中的有機(jī)物料能顯著增加土壤中細(xì)菌和真菌數(shù)量，而菌劑的加入使土壤細(xì)菌和放線菌的數(shù)量大幅度提高。

細(xì)菌與放線菌之和與真菌數(shù)量的比值是土壤微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)的重要特征指標(biāo)［23］。通過(guò)細(xì)菌和放線菌數(shù)量之和與真菌數(shù)量的比值分析土壤中微生物的群落結(jié)構(gòu)，從表2可以看出，使用生物肥料可以顯著改變當(dāng)歸根際土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)。與對(duì)照和載體處理相比，生物肥料處理的比值分別增加92.6%、39.2%，說(shuō)明施用生物肥料可以顯著改變當(dāng)歸根際土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)。

2.3 生物肥料對(duì)當(dāng)歸根際土壤脲酶和磷酸酶活性的影響

2.3.1 對(duì)土壤脲酶活性的影響 土壤酶是表征土壤中物質(zhì)、能量代謝旺盛程度和土壤質(zhì)量水平的一個(gè)重要生物指標(biāo)［24］。表3顯示，在當(dāng)歸根際施用生物肥料能夠顯著增加土壤脲酶活性。與對(duì)照相比，生物肥料處理的脲酶活性增加46.9%，與載體處理相比增加9.09%，差異顯著。

2.3.2 對(duì)土壤磷酸酶活性的影響 磷酸酶可以加速有機(jī)磷的脫磷速度，積累的磷酸酶對(duì)土壤磷素的有效性具有重要作用［25］。表3結(jié)果表明，與對(duì)照相比，生物肥料處理土壤酸性磷酸酶、堿性磷酸酶活性分別增加19.9%、43%，差異顯著；與載體處理相比，分別增加9.66%、8.51%。

2.4 生物肥料對(duì)土壤微生物功能多樣性影響

2.4.1 對(duì)土壤微生物平均顏色變化率（AWCD）的影響 AWCD反映土壤微生物的整體活性［26］，可作為土壤微生物活性的有效指標(biāo)［19,27］，不同施肥處理土壤的AWCD分析結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，不同施肥處理土壤微生物AWCD的總體變化趨勢(shì)隨著時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸提高，在培養(yǎng)24～120 h期間，曲線斜率最大，AWCD增長(zhǎng)率最高，表明此階段土壤微生物碳源代謝活性最高。不同處理間相比，施生物肥料處理AWCD值高于載體處理和對(duì)照，可見(jiàn)，施用生物肥料能提高土壤微生物代謝活性。

圖1 不同處理對(duì)土壤微生物AWCD的影響Fig. 1 Effects of different treatments on soil microganism AWCD

2.4.2 對(duì)土壤微生物群落功能多樣性指數(shù)的影響 通過(guò)計(jì)算培養(yǎng)120 h時(shí)的Shannon-Wiener物種豐富度指數(shù)（H'）、McIntosh物種均一度指數(shù)（U）、物種優(yōu)勢(shì)度指數(shù)（D）來(lái)表征土壤微生物群落代謝功能多樣性［28-29］。表4結(jié)果表明，在當(dāng)歸根際施用生物肥料后，土壤中微生物群落功能多樣性指數(shù)的變化趨勢(shì)與微生物利用單一碳源能力的趨勢(shì)基本一致，都是生物肥料處理最高，載體處理次之，對(duì)照最小。與對(duì)照相比，物種豐富度指數(shù)、均一度指數(shù)分別增加40.2%、6.6%；與載體處理相比，分別增加25.5%、1.6%；物種優(yōu)勢(shì)度指數(shù)（Sinpson）不同處理間基本無(wú)影響。說(shuō)明施用生物肥料可以提高當(dāng)歸根際土壤微生物豐富度指數(shù)和物種均一度指數(shù)，對(duì)物種優(yōu)勢(shì)度指數(shù)基本無(wú)影響。

表2 不同處理對(duì)當(dāng)歸根際土壤微生物數(shù)量的影響Table 2 Effects of different treatments on number of microorganisms in rhizosphere soil of A. sinensis

表3 不同處理對(duì)當(dāng)歸根際土壤酶活性的影響Table 3 Effects of different treatments on enzyme activity in rhizosphere soil of A. sinensis

表4 不同處理對(duì)當(dāng)歸根際土壤生物功能多樣性指數(shù)的影響Table 4 Effects of different treatments on functional diversity indexes of rhizosphere soil of A. sinensis

2.4.3 生物肥料對(duì)單一碳源的影響 不同施肥措施對(duì)土壤微生物群落碳源利用能力產(chǎn)生不同影響。AWCD高低可用來(lái)表征微生物對(duì)碳源的利用率高低［26］。計(jì)算出Eco-microPlate上的31種碳源96 h的Ci-R 值平均值，對(duì)變化較大的14種碳源進(jìn)行分析，表5結(jié)果顯示，施用生物肥料后可顯著提高D-木糖、葡萄糖-1-磷酸鹽、L-苯基丙氨酸、甘氨酰-L-谷氨酸、D，L-α-甘油、I-赤藻糖醇、N-乙酰基-D-葡萄胺7種碳源的利用率，降低了L-絲氨酸、丙酮酸甲酯、腐胺、4-羥基苯甲酸、D-半乳糖醛酸、衣康酸、D-蘋(píng)果酸7種碳源的利用率，使單一碳源的代謝發(fā)生變化。與對(duì)照相比，生物肥料處理的D-木糖、葡萄糖-1-磷酸鹽、L-苯基丙氨酸、甘氨酰-L-谷氨酸、D，L-α-甘油、I-赤藻糖醇、N-乙?；?D-葡萄胺的利用率分別增加89.8%、86.8%、17.3%、14.0%、35.5%、21.7%、91.3%；碳源L-絲氨酸、丙酮酸甲酯、腐胺、4-羥基苯甲酸、D-半乳糖醛酸、衣康酸、D-蘋(píng)果酸分別降低了18.2%、10.2%、12.2%、16.0%、10.4%、5.9%、15.5%。碳源利用發(fā)生了變化，說(shuō)明微生物種群發(fā)生變化，施用生物肥料改變了微生物群落結(jié)構(gòu)。

表5 不同處理對(duì)單一碳源的影響Table 5 Effects of different treatments on single carbon source

3 討論

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分，是土壤中物質(zhì)轉(zhuǎn)化的動(dòng)力，其群落結(jié)構(gòu)組成及其變化在一定程度上反映土壤質(zhì)量，同時(shí)也是克服連作障礙及其他土壤障礙因子的關(guān)鍵。楊永等［30］研究表明，在哈密瓜上施用微生物肥料能改變土壤真菌的群落結(jié)構(gòu)，降低根際病原真菌數(shù)量，使大量有益真菌繁衍。唐艷領(lǐng)［31］研究表明，在嚴(yán)重連作土壤上對(duì)辣椒施用微生物肥料能夠提高土壤中微生物數(shù)量，提高土壤酶活性，降低辣椒疫病的發(fā)生。胡麗可［32］在連作大棚中施用5406菌肥，辣椒根際土壤中細(xì)菌數(shù)量顯著增加，真菌數(shù)量減少，土壤酶脲酶、蔗糖酶、過(guò)氧化物酶活性顯著提高，也可以提高辣椒的品質(zhì)。可見(jiàn)生物肥料可以有效減輕土壤連作障礙的發(fā)生，增加土壤微生物數(shù)量和提高酶的活性，提高作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。本研究在當(dāng)歸上施用生物肥料后，當(dāng)歸根際土壤中細(xì)菌、真菌、放線菌都顯著增加，土壤脲酶、磷酸酶活性顯著增加，與前人研究結(jié)果基本一致。通過(guò)Biolog-MicroPlate方法測(cè)定微生物對(duì)31種的利用情況，表明生物肥料改變了14種碳源的利用率，施用生物肥料可以改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和組成的多樣性與均勻性不僅提高土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性與和諧性，同時(shí)也提高對(duì)土壤微生態(tài)環(huán)境惡化的緩沖能力［33］。土壤中微生物數(shù)量在一定程度上影響土壤酶的活性，土壤中酶活性是土壤肥力的一個(gè)重要指標(biāo)［34］。施用生物肥料可以顯著提高土壤脲酶、磷酸酶的活性。耿士均等［35］研究表明微生物菌劑和生物有機(jī)肥可顯著改善植物根周的微環(huán)境，調(diào)節(jié)菌群種類和數(shù)量，促進(jìn)有益菌群的生長(zhǎng)，土壤中微生物含量增加，可以提高各種酶活性。酶活性與上壤中各營(yíng)養(yǎng)元素的釋放與發(fā)育土壤中腐殖質(zhì)的形成以及土壤的結(jié)構(gòu)和物理狀況密切相關(guān)。張輝等［36］研究表明，生物有機(jī)無(wú)機(jī)復(fù)合肥可明顯提高土壤蔗糖酶、脲酶、磷酸酶活性，促進(jìn)土壤有機(jī)質(zhì)的分解轉(zhuǎn)化和速效養(yǎng)分釋放。本研究結(jié)果表明，施用生物肥料增加了土壤細(xì)菌和放線菌的數(shù)量，提高了微生物的活性和土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)多樣性［37］；土壤中微生物含量增加，從而提高了土壤的脲酶、磷酸酶等活性，由于酶促反應(yīng)增強(qiáng)，加速了土壤有機(jī)質(zhì)的分解和礦物質(zhì)養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化，有利于農(nóng)作物根系對(duì)養(yǎng)分的吸收，從而提高當(dāng)歸的產(chǎn)量。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，當(dāng)歸專用生物肥料對(duì)當(dāng)歸根的生長(zhǎng)有顯著促進(jìn)作用，施用生物肥料后當(dāng)歸的蘆頭直徑和根干重顯著增加，與對(duì)照相比，分別增加了31.39%、100.5%，提高了當(dāng)歸的商品性。施用生物肥料增加了土壤微生物的數(shù)量，與對(duì)照相比，細(xì)菌、真菌、放線菌分別增加154%、21.6%、34.7%，使土壤微生物功能多樣性發(fā)生變化；提高了土壤脲酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶活性，較對(duì)照分別增加46.9%、19.9%、43.0%。土壤中微生物數(shù)量增加，提高了土壤酶活性，加速了土壤有機(jī)質(zhì)的分解和礦物質(zhì)養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化，有利于農(nóng)作物根系對(duì)養(yǎng)分的吸收，從而提高當(dāng)歸產(chǎn)量。