劉丹 李然紅 陳鑫

摘要：為研究狗棗獼猴桃[Actinidia kolomikta （Maxim. et Rupr.） Maxim.]AkMYB5的功能，利用生物信息學工具和方法，對其編碼蛋白質的理化性質、親水/疏水性、跨膜結構、結構功能域、二級結構、三級結構、蛋白質修飾位點及同源性等進行分析和預測。結果表明，AkMYB5的cDNA全長為1 339 bp，CDS為1 053 bp，編碼蛋白由351個氨基酸構成的親水性非穩(wěn)定蛋白，屬于MYB5蛋白家族（PLN03212），主要構件為α-螺旋和不規(guī)則卷曲，與其他18種植物的MYB氨基酸序列進行比對發(fā)現(xiàn)，其與中華獼猴桃變種（Actinidia chinensis var. chinensis）AkMYB5的親緣關系較近。

關鍵詞：狗棗獼猴桃[Actinidia kolomikta （Maxim. et Rupr.） Maxim.];AkMYB5;生物信息學

Abstract： To obtain information about AkMYB5 gene from Actinidia kolomikta （Maxim. et Rupr.） Maxim.，the bioinformatics methods and tools were used to analysis the physical and chemical properties， hydrophilicity/hydrophobicity， transmenbranne domain，structure and function domain ，secondary structure，tertiary structure， protein modification sites and homology of MYB5 from Actinidia kolomikta. The results showed that the length of AkMYB5 cDNA was 1 339 bp and the coding area was 1 053 bp coding 351 amino acid. AkMYB5 was a unstable and hydrophilic protein belonging to the MYB5 superfamily （PLN03212）. The analysis also demonstrated that AkMYB5 main component was Alpha-helix and random coil. Compaired to MYBs of the other 18 plants， AkMYB5 had near relationships with Actinidia chinensis var. chinensis.

Key words： Actinidia kolomikta （Maxim. et Rupr.） Maxim.; AkMYB5; bioinformatics

狗棗獼猴桃[Actinidia kolomikta （Maxim. et Rupr.） Maxim.]別名深山木天蓼、狗棗子，獼猴桃屬大型落葉藤本植物，主要分布于中國東北三省、四川、云南等針葉混交林地。狗棗獼猴桃是最為耐寒的獼猴桃品種之一，是良好的抗寒育種資源，在生長發(fā)育過程中葉片顏色會發(fā)生動態(tài)變化，形成綠、白、粉、淺紅和紫紅的斑狀彩葉，其果實柔軟多汁、酸甜可口、維生素C含量較高，是一種藥食觀賞兼用植物[1-3]。植物的MYB蛋白能夠參與植物的生長發(fā)育、生長調節(jié)因子的信號傳導、抗逆性的調控、花青素的代謝等功能，是植物抗逆應激反應及發(fā)育調控的關鍵蛋白[4]。MYB作為植物中最大的轉錄因子家族之一，首次在玉米中被發(fā)現(xiàn)，隨后在許多植物中均被分離和鑒定，如擬南芥、百合、草莓、當歸、枸杞、煙草、棉花、水仙等，研究結果證明MYB對非生物脅迫應答響應起著重要作用[5-7]。Cominelli等[8]發(fā)現(xiàn)MYB能夠參與調控擬南芥的氣孔運動、細胞擴張及角質層的沉積以參與抗旱性。另外，MYB參與植物花青素的合成代謝，陳江等[9]研究表明在紅花的根、莖中MYB表達量較低，在花中表達量較高;MYB同時參與蘋果、梨、草莓、桑葚等果實的花青素合成[10]。本試驗以狗棗獼猴桃轉錄組數(shù)據(jù)為參考，篩選到AkMYB5的cDNA序列，利用生物信息學方法對其理化性質、疏水性/親水性、蛋白質結構功能域、二級結構、三級結構、蛋白質修飾位點及同源性等方面進行預測和分析，以期為狗棗獼猴桃AkMYB5功能研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料來源

狗棗獼猴桃AkMYB5的cDNA序列從作者所在實驗室轉錄組數(shù)據(jù)中獲得;葡萄（Vitis vinifera，RVW46342.1）、胡桃（Juglans regia，XP_018820139.1）、中華茶花（Camellia sinensis var. sinensis，THF94188.1）、中華獼猴桃變種（Actinidia chinensis var. chinensis，PSS10299.1）、茶樹（Camellia sinensis，XP_028093628.1）、可可樹（Theobroma cacao，XP_007025822.2）、哥倫比亞錦葵（Herrania umbratica，XP_021293847.1）、煙草（Nicotiana attenuata，XP_019229348.1）、榴蓮（Durio zibethinus，XP_022777375.1）、歐洲栓皮櫟（Quercus suber，XP_023877052.1）、土瓶草（Cephalotus follicularis，GAV67420.1）、樹棉（Gossypium arboreum，XP_017605289.1）、木薯（Manihot esculenta，XP_021596793.1）、毛果楊（Populus trichocarpa，XP_002305647.1）、麻瘋樹（Jatropha curcas，XP_012091477.1）、棉花（Gossypium hirsutum，XP_016726789.1）、柿子（Diospyros kaki，AKP06176.1）、白樺（Betula platyphylla，QBX99292.1）等植物氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中下載。

1.2 方法

狗棗獼猴桃AkMYB5蛋白的理化性質用ProtParam（https：//web.expasy.org/cgi-bin/protparam/ protparam）進行分析;采用NCBI-CDD進行保守結構域及蛋白家族預測（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/）;采用Inter-ProtScan（http：//www.ebi.ac.uk/ interpro/search/sequence-search）預測功能位點;采用NetOGlyc（http：//www.cbs.dtu.dk/ services/NetOGlyc/）對O-糖基化位點進行預測;采用 SOPMA 及PredictProtein 數(shù)據(jù)庫（https：//www.predictprotein.org/）對AkMYB5蛋白進行二級結構及蛋白質修飾位點預測;使用 SWISS-MODEL（http：//swissmodel.Expasy.org/）在線軟件預測蛋白質三級結構。從NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫中獲得18條不同植物的MYB氨基酸序列信息，利用MEGA5.1軟件的Neighbor-joining法構建蛋白質系統(tǒng)進化樹。

2 結果與分析

2.1 AkMYB5蛋白理化性質預測

利用ProtParam軟件對狗棗獼猴桃AkMYB5序列進行分析，結果表明，AkMYB5基因cDNA全長為1 339 bp，編碼區(qū)（CDS）為cDNA上第200～1 252個堿基，共編碼351個氨基酸，編碼蛋白質分子質量為39 699.45 u，理論等電點為5.87，負電荷殘基總數(shù)（Asp+Glu）為36，正電荷殘基總數(shù)（Arg+Lys）為31，分子式為C1741H2701N489O546S15，總原子數(shù)5 492，不穩(wěn)定指數(shù)為46.81，脂肪系數(shù)（Aliphatic index）為72.54，親水性（GRAVY）的平均水平為-0.585。這說明該蛋白為親水非穩(wěn)定性蛋白。該蛋白中含量最多的為絲氨酸，占11.7%;其次為亮氨酸和天冬酰胺，各占10.3%和9.4%;含量最少的為色氨酸占1.7%;吡咯賴氨酸及硒半胱氨酸含量為0（圖1）。通過ProtScale軟件分析預測，該基因蛋白的整個肽鏈中均含有親水性和疏水性氨基酸，得分最大為1.722，在第169個氨基酸處，最小為-2.222，在第17個氨基酸處;從整體分布看，氨基酸的負值多且分值大（圖2），根據(jù)蛋白質親水和疏水的得分判定該蛋白為親水蛋白。

2.2 AkMYB5信號肽和跨膜結構

信號肽常指多肽鏈中用于指導蛋白質跨膜轉移的特殊氨基酸序列，長度在5～30個氨基酸，包含信號肽的C端、N端和疏水核心區(qū)。SignalP-4.1預測AkMYB5蛋白不含信號肽（圖3），同時不存在跨膜結構（D-cut off為0.450<0.5）。

2.3 AkMYB5結構域預測

通過NCBI-CDD氨基酸序列的比對，對AkMYB5保守序列及其蛋白家族進行預測，結果表明，AkMYB5是MYB基因家族的成員（PLN03212），其第5～128氨基酸之間的序列區(qū)域為MYB5組的保守結構域，并同時含有SANT保守結構（圖4）。

2.4 AkMYB5蛋白二級、三級結構預測

使用SOPMA對AkMYB5蛋白的二級結構進行分析預測，結果顯示，該蛋白33.33%可能會形成螺旋（Helix），7.12%可能形成延伸鏈（Strand），3.42%可能形成轉角（Turn），56.13%為無規(guī)卷曲（Random coil），無二硫鍵的形成，沒有特殊的二級結構（圖5）。用SWISS-MODEL對AkMYB5蛋白進行三級結構的預測，結果如圖6所示。

2.5 蛋白質修飾位點的預測

蛋白質磷酸化是調節(jié)和控制蛋白質活力和功能的最基本、最普遍，也是最重要的機制，蛋白質的N-糖基化修飾是生物體調控蛋白質在組織和細胞中的定位、功能、活性、壽命和多樣性的一種普遍的翻譯后修飾。通過PredictProtein對N-糖基化位點進行預測，該蛋白內(nèi)有6個潛在的N-糖基化位點，分別在150（NLSR）、209（NQSQ）、252（NFSE）、264（NLSK）、292（NFSF）及317（NSSS）氨基酸處。O-糖基化是另一種重要的蛋白質翻譯后修飾，O-糖鏈能維持所連接蛋白質部分的空間構象。采用NetOGlyc4.0 server對O-糖基化位點進行預測，預測分數(shù)均大于0.5的認為是陽性，故推測該蛋白內(nèi)含38個O-糖基化位點。Predict Protein預測分析結果見表1，可知AkMYB5含有6個糖基化位點（N-glycosylation site）、5個酪蛋白磷酸激酶Ⅱ磷酸化位點（Casein kinase II phosphorylation site）、5個十四烷?；稽c（N-myristoylation site）、1個酪氨酸激酶磷酸化位點（Tyrosine kinase phosphorylation site）、3個蛋白激酶C磷酸化位點（Protein kinase C phosphorylation site）、1個ATP/GTP結合位點（ATP/GTP-binding site motif A （P-loop））序列。

2.6 氨基酸序列同源性對比

在NCBI數(shù)據(jù)庫中分別下載葡萄、胡桃、中華茶花、中華獼猴桃變種、茶樹、可可樹、哥倫比亞錦葵、煙草、榴蓮、歐洲栓皮櫟、土瓶草、樹棉、木薯、毛果楊、麻瘋樹、棉花、柿子、白樺18種植物的MYB氨基酸序列，與狗棗獼猴桃AkMYB氨基酸序列進行同源性分析，結果表明，狗棗獼猴桃AkMYB氨基酸序列與中華獼猴桃原變種親緣關系較近，而與葡萄、中華茶花等植物親緣關系較遠（圖7）。

3 討論

MYB直接或間接參與植物的生長發(fā)育、花青素合成、逆境響應及信號調節(jié)等生理生化過程。目前已經(jīng)從多種植物中克隆到MYB基因包括擬南芥、煙草、白樺、棉花、矮牽牛等，并在類黃酮化合物合成中發(fā)揮重要作用。本研究利用已測的狗棗獼猴桃轉錄組數(shù)據(jù)，篩選出狗棗獼猴桃MYB基因cDNA序列信息，并對其進行了生物信息學分析。結果表明，AkMYB5基因cDNA全長為1 339 bp，編碼區(qū)（CDS）為cDNA上第200～1 252個堿基，共編碼351個氨基酸，是MYB5（PLN03212）家族的一員，屬于親水性、非穩(wěn)定的蛋白，蛋白中絲氨酸、亮氨酸和天冬酰胺含量較高，沒有跨膜結構。在NCBI數(shù)據(jù)庫中對AkMYB5進行Blast，結果顯示，與狗棗獼猴桃MYB序列一致性最高的為96.30%，最低的為54.55%。選取18條氨基酸序列與AkMYB5蛋白進行比對，經(jīng)MAGA5.1分析，AkMYB5蛋白與中華獼猴桃原變種親緣關系較近，而與葡萄、中華茶花等植物親緣關系較遠。以上結果為進一步研究狗棗獼猴桃AkMYB5基因功能提供了一定的理論基礎。

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