周曉帆 李靜 王瑞

摘要：以安康市花魔芋（Amorphophallus konjac）為材料提取基因組，對matK基因序列進行擴增，擴增產物經凝膠電泳分析后送生物技術公司測序，并對測序結果進行分析。結果表明，安康市花魔芋matK基因全長1 551 bp，預測編碼516個氨基酸;系統(tǒng)進化樹結果顯示，花魔芋與Amorphophallus? maxwellii、田陽魔芋（Amorphophallus? corrugatus）和西盟魔芋（Amorphophallus? krausei）的親緣關系最近。

關鍵詞：花魔芋（Amorphophallus konjac）;matK基因;序列分析;安康市

Abstract： The genome of the Amorphophallus konjac from Ankang city was extracted and the matK gene sequence was amplified. After confirmed by gel electrophoresis， amplified product was sequenced and analyzed. Results showed that the matK gene of Amorphophallus konjac from Ankang city was 1 551 bp in length and predicted to encode 516 amino acids. The phylogenetic tree showed that the Amorphophallus konjac had the closest relationship with Amorphophallus maxwellii， Amorphophallus corrugatus and Amorphophallus krausei.

Key words： Amorphophallus konjac; matK gene; sequence analysis; Ankang city

魔芋（Amorphophallus rivieri Durieu）為多年生天南星科草本植物，是世界上惟一能夠大量提供葡甘露聚糖的重要經濟作物。目前已命名的魔芋種屬達200多個，中國已記載的魔芋屬種約20種[1]，廣泛分布在秦嶺大巴山、四川盆地、云貴高原、滇南和臺灣等地區(qū)[2]。當前的魔芋種植是在傳統(tǒng)的栽培基礎上發(fā)展起來的，地方品種之間的特性差異較大[3]，種質資源性狀差異明顯，遺傳多樣性豐富[4]，為魔芋的分類及種質資源鑒定帶來了一定困難。

近年來，分子標記技術已成為檢測植物種質資源多樣性和鑒定種質親緣關系的重要工具，顯示出較好的應用前景[5]。matK序列位于葉綠體基因組trnK基因的內含子中，是葉綠體基因組蛋白編碼基因中進化速率最快的基因之一，被廣泛應用于植物種質資源的鑒定和親緣關系的研究[6-8]。位于秦巴腹地的陜西省安康市有著悠久的魔芋種植歷史[9]。本研究從安康市花魔芋（Amorphophallus konjac）中克隆得到matK基因的全長序列，并對其進行簡單的生物信息學分析，為魔芋的種質資源鑒定和親緣關系研究提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用花魔芋由安康學院保存，取新鮮葉片用去離子水沖洗干凈，吸水紙吸干后于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 葉綠體DNA的提取? 參照Fulton等[10]的方法提取花魔芋的基因組，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，-20 ℃保存。

1.2.2 常規(guī)PCR擴增反應 根據NCBI公布的芋屬葉綠體基因組序列（GenBank 登錄號KY769273.1），用軟件Primer Premier 5.0設計matK的引物，正向：5′-TGGAAAGATAGGAAGAAGA -3′，反向：5′-CTTAGATTAGATCCCGAAA-3′。 PCR擴增體系：ddH2O 35 μL，10×緩沖液（buffer）5 μL，10 mmol/L dNTPs 4 μL，100 ng/μL DNA模板1 μL，10 μmol/L正向引物2 μL，10 μmol/L反向引物2 μL，5 U/μL Taq酶1 μL。PCR擴增程序：95 ℃預變性3 min;94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，變性、退火、延伸3個階段34個循環(huán);72 ℃終延伸5 min。PCR產物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 測序及分析 PCR產物送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。測得的序列用BioEdit軟件進行處理，在NCBI（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）網站進行Blast 比對，用MEGA 7.0構建分子系統(tǒng)進化樹。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增及測序結果分析

對PCR擴增產物進行凝膠分析顯示，擴增片段長度約1 800 bp（圖1），與預期相符。對測序結果分析得知該基因全長1 551 bp，預測編碼516個氨基酸（圖2）。將該核苷酸序列在NCBI進行Blastn，發(fā)現(xiàn)該序列與花魔芋matK基因序列（AF387398.1）有2個堿基的差異，序列相似性達99%。

2.2 matK基因的系統(tǒng)進化分析

以桑樹（Morus alba）為外類群，用Neighbor-joining法構建魔芋屬matK基因的系統(tǒng)進化樹。結果（圖3）顯示，安康市花魔芋與Amorphophallus maxwellii、田陽魔芋（Amorphophallus corrugatus）和西盟魔芋（Amorphophallus krausei）的親緣關系最近。

3 討論

葉綠體基因與核基因組和線粒體基因組相比較為保守，matK序列的進化速率快[11]，一般用于科內和種間關系的研究。在植物界中，很難找到一個合適的DNA條形碼來區(qū)分所有的物種，在分子水平鑒別物種時可以采用序列組合的方式，一方面鑒別的準確性高，另一方面可以分析物種親緣關系的遠近。各國的研究學者們在植物DNA條形碼的研究中提出過多種序列組合分析的方案[12]，中國學者認為三序列組合matK+trnK-psbA+rbcL和兩序列組合matK+rbcL、matK+trnK-psbA、trnK-psbA+rbcL對芋族有較好的鑒定率，但是采用三序列組合識別準確率低于兩序列組合[13]。

本研究克隆并分析了安康市花魔芋的matK序列，Neighbor-joining法構建的系統(tǒng)進化樹表明安康市花魔芋與Amorphophallus maxwellii、田陽魔芋（Amorphophallus corrugatus）和西盟魔芋（Amorphophallus krausei）有較近的親緣關系。鑒于單獨的matK序列對親緣關系鑒定存在一定的局限性，因此今后的研究中可以考慮采用多種序列組合的方式進行。

參考文獻：

[1] 劉二喜. 魔芋種質資源分類鑒定技術、引種適應性評價及繁殖特性研究[D]. 湖北恩施：湖北民族學院，2016.

[2] 劉佩瑛. 魔芋學[M]. 北京：中國農業(yè)出版社，2004.

[3] 白立偉，牛 義，劉海利，等. 魔芋種質資源及育種研究進展[J]. 南方農業(yè)，2016，10（4）：48-52.

[4] 張風潔，劉海利，蔣學寬，等. 魔芋種質資源形態(tài)標記遺傳多樣性分析[J]. 中國蔬菜，2013（18）：53-60.

[5] 朱巖芳，何洪兵，于莉莉. 分子標記技術在植物種質鑒定中的鑒別效率比較[J]. 安徽農業(yè)科學，2015，43（10）：38-39.

[6] PENJOR T， YAMAMOTO M， UEHARA M， et al. Phylogenetic relationships of Citrus and its relatives based on matK gene sequences[J].? PLoS One，2013，8（4）： e62574.

[7] 王 彤，劉 靜，郭 月，等. 基于matK基因和ITS序列的江蘇地方豆類植物的親緣關系研究[J]. 南京農業(yè)大學學報，2017，40（5）：795-803.

[8] 張安世，司清亮，張為民，等. 基于matK基因的幾種苔蘚植物的親緣關系分析[J]. 河南農業(yè)科學，2012，41（1）：110-112.

[9] 崔 鳴. 現(xiàn)代魔芋產業(yè)發(fā)展研究與實踐的“安康模式”分析[J]. 湖北農業(yè)科學，2017，56（18）：3598-3601.

[10] FULTON T M， CHUNWONGSE J， TANKSLEY S D. Microprep protocol for extraction of DNA from tomato and other herbaceous plants[J].? Plant Mol Biol Report，1995，13（3）：207-209.

[11] 馮婷婷. 芥菜型油菜葉綠體基因組DNA多態(tài)性研究[D]. 武漢：華中農業(yè)大學，2017.

[12] KRESS W J. Use of DNA barcodes to identify flowering plants[J].? PNAS，2005，102（23）：8369-8374.

[13] 劉宇婧. DNA條形碼在天南星科芋族植物研究中的應用[D]. 北京：中央民族大學， 2011.