孟現(xiàn)堯 ， 朱曉振 ， 賈晨晨 ， 衣悅濤

（1.中國科學(xué)院煙臺(tái)海岸帶研究所，山東煙臺(tái) 264003；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3.中國科學(xué)院海洋大科學(xué)研究中心，山東青島266071）

凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）是世界最主要的養(yǎng)殖對(duì)蝦品種，也是我國最大的水產(chǎn)品出口品種；同時(shí)對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)也是我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的支柱性產(chǎn)業(yè)（陳學(xué)洲等，2016）。目前，我國凡納濱對(duì)蝦的年產(chǎn)量約為150萬噸。但是由于凡納濱對(duì)蝦缺乏特異性免疫，在大規(guī)模高密度養(yǎng)殖模式下極易感染蝦病，死亡率極高，2017年全國平均養(yǎng)殖成功率僅有20% ～30%（陳建等，2018）。這嚴(yán)重制約了對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。

當(dāng)使用抗生素不能有效控制疫情，并且造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染，進(jìn)而加速耐藥菌株產(chǎn)生的問題后（謝達(dá)堯，2018；陳燕軍，2007）。為了改善對(duì)蝦的抗病性，減少抗生素的使用，利用益生元、益生菌完善對(duì)蝦腸道健康成為一種效果良好的新方法。研究表明，益生菌可以改善水體，促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物生長，抑制致病菌，強(qiáng)化宿主先天免疫（Farzanfar等，2010）；而益生元可以通過促進(jìn)益生菌的增殖來提高飼料轉(zhuǎn)化率，改善黏膜屏障修復(fù)細(xì)胞損傷，調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，提高抗病力 （Ringo/等，2010）。地衣芽孢桿菌因?yàn)榭梢蕴峁I養(yǎng)物質(zhì)，并且具有促進(jìn)生長，調(diào)節(jié)腸道微生物平衡，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，改善水質(zhì)等作用，而廣泛應(yīng)用為飼料添加劑（袁慧坤等，2019）。菊粉是一種水溶性益生元，具有調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡，提高宿主非特異性免疫等功能。菊芋全粉成本更低，微溶于水，含有50%以上的菊粉。所以本試驗(yàn)選擇菊芋全粉和地衣芽孢桿菌為飼料添加劑應(yīng)用于對(duì)蝦養(yǎng)殖中，研究其對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長性能、免疫應(yīng)答以及腸道菌群變化的影響。以期為菊芋全粉和地衣芽孢桿菌在對(duì)蝦健康養(yǎng)殖上的聯(lián)合應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 試驗(yàn)所用凡納濱對(duì)蝦來自山東東方海洋科技股份有限公司，初始平均體重為（0.9±0.1）g。在中國科學(xué)院牟平海岸帶環(huán)境綜合試驗(yàn)站，使用 200 L塑料水箱飼養(yǎng)，水溫（28±1）℃，pH 8.1，鹽度 30‰。 每天投喂 4 次（7：30、11：00、17：00、21：00），投喂量為對(duì)蝦體重的 5%，若沒有食物殘?jiān)Ｓ啵瑒t第二日飼料投喂量增加20%。每日及時(shí)清除糞便與食物殘?jiān)?，換水80%，暫養(yǎng)一周后用于試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 暫養(yǎng)結(jié)束后，挑選1200尾健康對(duì)蝦，隨機(jī)分為4組，每組3個(gè)平行，每個(gè)平行100尾對(duì)蝦。對(duì)照A組喂食基礎(chǔ)飼料，試驗(yàn)B、C、D組分別在基礎(chǔ)飼料中添加1%菊芋全粉、108cfu/g地衣芽孢桿菌和1%菊芋全粉+108cfu/g地衣芽孢桿菌，飼養(yǎng)周期為4周?；A(chǔ)飼料為煙臺(tái)遠(yuǎn)景生物技術(shù)有限公司的對(duì)蝦飼料原料，按配比混勻后加水揉勻，擠壓造粒，自然晾干。營養(yǎng)水平如表1所示。

表1 基礎(chǔ)飼料營養(yǎng)成分%

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.3.1 生長性能測(cè)定 試驗(yàn)前記錄平均初重W0，初始尾數(shù)N0。飼養(yǎng)四周后，各組對(duì)蝦禁食24 h，記錄最終平均體重 Wt，最終尾數(shù) Nt。 成活率（SR）、特殊生長率（SGR）、飼料轉(zhuǎn)化率（FCR）計(jì)算公式如下：

式中：T為飼養(yǎng)試驗(yàn)天數(shù)，d；F為對(duì)蝦的攝食總量，g。

1.3.2 血細(xì)胞計(jì)數(shù)及呼吸爆發(fā)測(cè)定

1.3.2.1 血細(xì)胞計(jì)數(shù) （THC） 試驗(yàn)結(jié)束后，取3只對(duì)蝦血淋巴與抗凝劑 （0.02 moL EGTA，0.48 moL NaCl，0.019 moL KCl和.068 moL Tris-HCl，pH 7.6）1：1混合制成細(xì)胞懸液，在光學(xué)顯微鏡下通過血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

1.3.2.2 呼吸爆發(fā) （RB） 將細(xì)胞懸液按照Hong等（2006）的適當(dāng)調(diào)整后測(cè)量巨噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)。

1.3.3 血淋巴免疫因子活性測(cè)定 將對(duì)蝦在冰盤上用1 mL針筒在頭胸甲處取血淋巴，在4℃、3000 r/min下離心10 min，取上清-80℃保存，用作血淋巴免疫指標(biāo)的測(cè)定。對(duì)蝦血淋巴的總抗氧化能力（T-AOC）和溶菌酶（LZM）使用南京建成公司試劑盒測(cè)定。

1.3.4 腸道微生物分析 在冰盤上取出蝦線，無菌水清洗，-20℃保存，送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行測(cè)序和生物信息學(xué)分析。根據(jù)16S rRNA基因V3～V4區(qū)序列設(shè)計(jì)如下引物：正向引物338F 5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’；806R 5’ -GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’。原始數(shù)據(jù)濾掉低質(zhì)量序列后得到有效數(shù)據(jù)，進(jìn)行OTUs（Operational Taxonomic Units） 聚類，分析微生物α多樣性（Chao指數(shù)、Shannon指數(shù)及Simpson指數(shù)）、β多樣性和微生物群落組成、豐富度，發(fā)掘不同試驗(yàn)組之間的差異。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析 數(shù)據(jù)用 SPSS 18軟件進(jìn)行單素方差分析（One-way ANOVA），結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，當(dāng)P＜0.05時(shí)為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 菊芋全粉與芽孢桿菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長性能的影響 由表2可知，與基礎(chǔ)飼料對(duì)照A組相比，所有試驗(yàn)組的最終體重和特殊生長率都沒有顯著性差異（P＞0.05）。另外，108cfu/g地衣芽孢桿菌試驗(yàn)C組存活率顯著高于對(duì)照A組 （P＜0.05）；1%菊芋全粉試驗(yàn)B組和108cfu/g地衣芽孢桿菌試驗(yàn)C組同對(duì)照A組相比，飼料利用率顯著提高（P＜0.05）。

表2 菊芋全粉與芽孢桿菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長性能的影響

2.2 菊芋全粉與芽孢桿菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦免疫能力的影響

2.2.1 菊芋全粉與芽孢桿菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦THC的影響 由圖1可知，與對(duì)照A組（0.35×106/mL）相比，1%菊芋全粉試驗(yàn) B 組（0.44×106/mL）與 108cfu/g地衣芽孢桿菌試驗(yàn)C組（0.86×106/mL）血細(xì)胞數(shù)目沒有顯著性差異 （P＞0.05），1%菊芋全粉+108cfu/g地衣芽孢桿菌試驗(yàn)D組（1.17×106/mL）具有顯著性差異（P ＜ 0.05）。

2.2.2 菊芋全粉與芽孢桿菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦RB的影響 如圖2所示，108cfu/g地衣芽孢桿菌試驗(yàn)C組與1%菊芋全粉+108cfu/g地衣芽孢桿菌試驗(yàn)D組RB相對(duì)值（1.43、1.90）較對(duì)照A組顯著提高（P＜0.05），但試驗(yàn)C、D組之間沒有顯著性差異（P ＞ 0.05）。

2.2.3 菊芋全粉與芽孢桿菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦血淋巴免疫因子應(yīng)答的影響 由圖3可知，與基礎(chǔ)飼料對(duì)照A組（0.24 U/mL）相比，所有試驗(yàn)組T-AOC活性 （0.38、0.32、0.39 U/mL） 都顯著提高 （P ＜0.05），且不同試驗(yàn)組之間沒有顯著性差異，其中以1%菊芋全粉+108cfu/g地衣芽孢桿菌試驗(yàn)D組T-AOC活性最高。如圖4所示，與基礎(chǔ)飼料對(duì)照A組（70.69 U/mL）相比，所有試驗(yàn)組LZM活性（108.82、145.81、135.24 U/mL）都顯著提高 （P ＜0.05），以108cfu/g地衣芽孢桿菌試驗(yàn)C組LZM活性最高，不同試驗(yàn)組之間沒有顯著性差異。

2.3 菊芋全粉與芽孢桿菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道微生物的影響

2.3.1 菊芋全粉與芽孢桿菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道微生物α多樣性的影響 經(jīng)過四周的養(yǎng)殖試驗(yàn)，分析各試驗(yàn)組對(duì)蝦的腸道菌群變化。試驗(yàn)組平均有（51937±2953）個(gè)高質(zhì)量的序列，這些序列可以聚類成1126個(gè)特殊的操作分類學(xué)單位（OTUs，序列標(biāo)識(shí)97%）。圖5～7顯示，添加菊芋全粉與地衣芽孢桿菌后，凡納濱對(duì)蝦腸道菌群豐富度（Chao指數(shù)）、多樣性（Shannon 指數(shù)）、均勻度（Simponeven指數(shù)）均無顯著性變化（P＞0.05）。但是108cfu/g地衣芽孢桿菌試驗(yàn)C組和1%菊芋全粉+108cfu/g地衣芽孢桿菌試驗(yàn)D組腸道菌群豐富度具有不同程度的提高，菊芋全粉與地衣芽孢桿菌表現(xiàn)出了一定的協(xié)同作用；1%菊芋全粉試驗(yàn)B組和1%菊芋全粉+108cfu/g地衣芽孢桿菌試驗(yàn)D組腸道菌群多樣性也有不同程度提高。

2.3.2 菊芋全粉與芽孢桿菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道微生物β多樣性的影響 基于Bray-Curtisdistance算法的主坐標(biāo)分析（PCoA）表明，試驗(yàn)對(duì)蝦腸道菌群結(jié)構(gòu)按照處理狀況聚類，其中第一軸和第二軸共同解釋了73.53%的腸道微生物群落差異 （圖8）。試驗(yàn)組與對(duì)照A組之間的分散程度存在顯著性差異，菊芋全粉與芽孢桿菌可以改變凡納濱對(duì)蝦腸道微生物的菌落聚集情況。非度量多維尺度分析（NMDS）也得出了相似的結(jié)論（圖9）。

2.3.3 菊芋全粉與芽孢桿菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道微生物種類的影響 通過物種注釋分析，評(píng)估各試驗(yàn)組對(duì)蝦腸道微生物種類的相對(duì)豐度，對(duì)其進(jìn)行比較分析，在門的水平上發(fā)現(xiàn)了4個(gè)主要菌群（圖10～11）。根據(jù)豐度的排名依次為變形菌門（74.28% ～ 88.08%，α-變形菌綱、γ-變形菌綱）、擬桿菌門（7.69%～21.57%，擬桿菌綱）、放線菌門（1.08% ～3.60%，放線菌綱）、厚壁菌門（0.06% ～3.11%，芽孢桿菌綱）。其中放線菌門在試驗(yàn)組之間存在顯著性差異。

通過組間差異顯著性檢驗(yàn)可知，在目水平上，弧菌目最多，然后是紅桿菌目、黃桿菌目以及交替單胞菌目（圖12）。其中，1%菊芋全粉試驗(yàn)B組對(duì)蝦腸道弧菌目相對(duì)豐度比例顯著低于其他試驗(yàn)組，并且其紅桿菌目、黃桿菌目和交替單胞菌目相對(duì)豐度顯著高于其他試驗(yàn)組（P＜0.05）。這可能是因?yàn)榫沼笕劭梢栽黾游锓N豐富度，調(diào)節(jié)腸道菌群平衡；但同樣添加了1%菊芋全粉的試驗(yàn)D組卻沒有這種現(xiàn)象。

3 討論

3.1 菊芋全粉與芽孢桿菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長性能的影響 有關(guān)益生元、益生菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長性能影響的研究有很多。但是影響效果報(bào)導(dǎo)不一。例如，Li等（2018）研究表明，益生元可以提高對(duì)蝦生長速度；Boonmee等（2015）試驗(yàn)得出，益生元、益生菌可以使對(duì)蝦高產(chǎn)的結(jié)論；Widagdo等（2012）試驗(yàn)結(jié)果表明，益生元可以提高對(duì)蝦存活率。而Bolívar等（2013）試驗(yàn)報(bào)道，益生元、益生菌對(duì)生長性能無影響；Li等（2007）也得出了益生元不能提高對(duì)蝦增重率，飼料轉(zhuǎn)化率和存活率的結(jié)論；Anuta等（2016）發(fā)現(xiàn)，益生元對(duì)增重率、存活率的影響不顯著。這可能與益生元的種類、使用方法或?qū)ξr的品種、大小和飼養(yǎng)方式等有關(guān)。本研究結(jié)果表明，飼料中添加108cfu/g地衣芽孢桿菌可以顯著提高對(duì)蝦存活率；飼料中分別添加了1%菊芋全粉和108cfu/g地衣芽孢桿菌的兩個(gè)試驗(yàn)組均可顯著提高對(duì)蝦的飼料利用率。和對(duì)照A組相比，試驗(yàn)組最終體重和特殊生長率沒有顯著性差異。并且試驗(yàn)中菊芋全粉與地衣芽孢桿菌沒有表現(xiàn)出協(xié)同作用。這與Li等（2009）的結(jié)果一致，具體機(jī)理需要進(jìn)一步研究分析。

3.2 菊芋全粉與芽孢桿菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦免疫力的影響 集約化的對(duì)蝦養(yǎng)殖，極易感染多種致病菌，使對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)停滯不前。因?yàn)榧讱?dòng)物缺乏特異性免疫，所以在清除病原體的免疫過程中，非特異性免疫的作用至關(guān)重要（Mithieux，2018）。THC數(shù)量可以一定程度上體現(xiàn)機(jī)體的細(xì)胞免疫水平（陳效儒，2009；Jiang 等，2004）。 本研究中分別添加1%菊芋全粉和108cfu/g地衣芽孢桿菌可以適當(dāng)增加THC數(shù)量，但沒有顯著性差異。二者的聯(lián)合使用卻可以顯著增加THC數(shù)量，這表明二者具有協(xié)同作用。盡管菊粉和地衣芽孢桿菌增加THC數(shù)量的機(jī)理尚不明確，但是試驗(yàn)結(jié)果顯示，二者確實(shí)可以通過增加血細(xì)胞數(shù)量來提高對(duì)蝦的免疫反應(yīng)。呼吸爆發(fā)（RB）是吞噬細(xì)胞清除病原體時(shí)的免疫機(jī)制，已廣泛作為評(píng)估非特異性免疫防御病原體的指標(biāo)。本研究中1%菊芋全粉對(duì)RB沒有影響。108cfu/g地衣芽孢桿菌可以顯著提高對(duì)蝦RB；1%菊芋全粉與108cfu/g地衣芽孢桿菌聯(lián)合使用具有一定的協(xié)同作用，可以進(jìn)一步提高RB，但沒有顯著性。這一結(jié)果與鄭玉等 （2017）和Zhang等（2011）的結(jié)論相似。凡納濱對(duì)蝦的代謝活動(dòng)會(huì)產(chǎn)生大量活性氧損傷機(jī)體，所以對(duì)蝦的T-AOC活性與免疫健康息息相關(guān) （Wu等，2014；張克烽等，2007）。LZM可以水解革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁中的乙酰氨基多糖，因此可作為對(duì)蝦非特異性免疫功能的指標(biāo)。本研究中1%菊芋全粉與108cfu/g地衣芽孢桿菌都能夠顯著性增強(qiáng)T-AOC和LZM活性，但是二者聯(lián)合使用沒有明顯的協(xié)同作用。這與張?jiān)拢?017）、Zhang等（2011）的結(jié)果相似。 然而，菊芋全粉和地衣芽孢桿菌在凡納濱對(duì)蝦免疫性能上影響的機(jī)理還需要進(jìn)一步的試驗(yàn)闡明。

3.3 菊芋全粉與芽孢桿菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道微生物的影響 本研究使用Illumina Miseq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)凡納濱對(duì)蝦的腸道生物群落進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)變形菌門、擬桿菌門、放線菌門為對(duì)蝦腸道內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌群，這一發(fā)現(xiàn)與裴鵬兵等（2018）的結(jié)果吻合。其中變形菌中相對(duì)豐度最高的是弧菌目，包括80多種細(xì)菌，多為機(jī)會(huì)致病菌，而像霍亂弧菌、副溶血性弧菌、哈維氏弧菌、溶藻弧菌等都是對(duì)蝦養(yǎng)殖中的易感病原菌。本研究結(jié)果表明添加1%菊芋全粉可以顯著降低弧菌目的相對(duì)豐度，同時(shí)顯著促進(jìn)紅桿菌目、黃桿菌目的生長，大幅度調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，此結(jié)果與Yamazaki等（2016）的研究結(jié)果一致。而108cfu/g地衣芽孢桿菌組與對(duì)照組相比菌群豐度差異較小，可知單獨(dú)添加地衣芽孢桿菌無法有效調(diào)節(jié)對(duì)蝦的腸道，這可能與地衣芽孢桿菌無法在對(duì)蝦腸道中有效定植有關(guān)（Zhang等，2011）。同時(shí)添加了1%菊芋全粉與108cfu/g地衣芽孢桿菌的試驗(yàn)組可以降低弧菌目的相對(duì)豐度，促進(jìn)紅桿菌目生長，但是效果不顯著，二者之間的協(xié)同作用不明顯，可能與養(yǎng)殖時(shí)間過短有關(guān)系。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)紅桿菌目的比例與對(duì)蝦特殊生長率成正相關(guān)，這與Jia等（2019）得出紅桿菌可以促進(jìn)水產(chǎn)生物生長速度的結(jié)論一致，這可能是因?yàn)榧t桿菌可以產(chǎn)生聚羥基丁酸酯，進(jìn)而促進(jìn)對(duì)蝦的生長。然而其作用機(jī)理尚無合理解釋，菊芋全粉與地衣芽孢桿菌影響腸道菌群的作用機(jī)制需要進(jìn)一步的試驗(yàn)解析。本研究結(jié)果顯示不同的試驗(yàn)組間對(duì)凡納濱對(duì)蝦的腸道菌落豐富度、均勻度和多樣性盡管有一定影響，但是不顯著。在綱水平上添加了1%菊芋全粉的試驗(yàn)組具有更多樣的生物群落。這與Dimitroglou等（2010）利用甘露寡糖可以增加金頭鯛腸道菌群豐富度和多樣性的結(jié)果相似。也有研究表示益生元會(huì)使鯛魚腸道菌群豐富度降低（Cerezuela等，2013）。實(shí)際上，益生元和益生菌的實(shí)際功效受多種因素影響，其來源、用量和使用方法的不同，應(yīng)用對(duì)象的種類、年齡以及養(yǎng)殖條件的差異均可影響最終效果。然而，其作用機(jī)理復(fù)雜，需要進(jìn)一步探討。

4 結(jié)論

108cfu/g地衣芽孢桿菌可以顯著提高對(duì)蝦的存活率和飼料利用率，同時(shí)可以提高T-AOC和LZM的活性；1%菊芋全粉和108cfu/g地衣芽孢桿菌聯(lián)合使用可以顯著提高THC與RB能力。另外，飼料添加劑對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道微生物的α多樣性有一定影響；與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組之間的菌落組成更為同源，這說明飼料添加劑可以顯著的改變腸道菌群物種豐度。綜上所述，菊芋全粉與地衣芽孢桿菌均可在不同程度上調(diào)節(jié)對(duì)蝦腸道菌群，在免疫活性的提高上具有一定的協(xié)同促進(jìn)效果，因此它們具備作為對(duì)蝦免疫增強(qiáng)劑的潛在價(jià)值。