杜鈺瑩，王 悅，賴治臻，田志新*，李智立*

(1.中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所 北京協(xié)和醫(yī)學院基礎學院 生物物理及結(jié)構(gòu)生物學系， 北京 100005;2.同濟大學 化學科學與工程學院 上海市化學品分析風險評估與控制重點實驗室， 上海 200092)

肺癌(lung cancer)是全球高發(fā)的惡性腫瘤之一[1]。慢性肺炎的癥狀與早期肺癌相似[2]。肺部疾病與多種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變相關[3-4]，N-糖基化修飾是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的常見形式之一，它對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[5]，在不同的病生理狀態(tài)下蛋白質(zhì)N-糖基化修飾存在顯著差異[6-7]。目前大部分研究主要關注總蛋白質(zhì)的N-糖基化修飾[7]，對疾病特異蛋白質(zhì)N-糖基化修飾報道的較少[8-10]。

大量臨床樣本的研究證實，血液中免疫炎性相關蛋白復合物(immunoinflammation-related protein complexes, IIRPCs)與慢性疾病發(fā)生、發(fā)展密切相關[11]，且其中的免疫球蛋白G(IgG)保守區(qū)(Fc)N-糖基化修飾可個體化區(qū)分良性疾病和癌[8,10]。本研究采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS)技術(shù)，鑒定了肺癌和慢性肺炎患者血清中IIRPCs的蛋白質(zhì)N-聚糖和連接位點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象：肺腺癌患者和慢性肺炎患者血清樣本各1份。樣本收集嚴格遵循人體醫(yī)學研究倫理要求，并經(jīng)中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所倫理審查委員會批準(倫理審批編號：020-2014)。

1.1.2 主要試劑：甘氨酸、甲叉雙丙烯酰胺、丙烯酰胺、三羥基甲基氨基甲烷、考馬斯亮藍G250、過硫酸銨、硼酸和四甲基乙二胺(Amresco公司)；碳酸氫銨(Sigma-Fluka公司)；色譜級乙腈和色譜級三氟乙酸(Thermo Fisher Scientific公司)；測序級改良胰蛋白酶(Roche 公司)。

1.2 方法

1.2.1 樣本前處理：采用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(native-polyacrylamide gel electrophoresis，native-PAGE)從血清中分離IIRPCs[8]。血清用量為200 μL，電泳前以1∶1比例與1×native-PAGE上樣緩沖液混合。每塊凝膠以10 mA恒流電泳1.5 h，之后調(diào)整為25 mA恒流電泳3 h，凝膠用考馬斯亮藍G250染色。依據(jù)文獻報道方法將IIRPCs目標條帶切下[8,11]，18.2 MΩ超純水清洗，置于600 μL離心管中。用胰蛋白酶(12.5 ng/μL，25 mmol/L NH4HCO3)酶解目標條帶內(nèi)蛋白。吸取酶解液，用真空冷凍濃縮儀低溫干燥。采用石墨相氮化碳富集糖肽[9]。將肺癌(或良性疾病)樣本處理液平均分為兩份，一份用0.025%的氨水溶液洗脫，另一份用0.1%三氟乙酸水溶液洗脫。將兩份洗脫液混合后用真空冷凍濃縮儀濃縮，得到干燥的富集樣本。將干燥后的樣本用18.2 MΩ超純水重溶，濃度約為1 g/L。

1.2.2 高效液相色譜分離條件：完整N-糖肽采用DionexUltiMate 3000 RSLCnano-HPLC系統(tǒng)進行分離，實驗室自制分析柱(75 μm×75 cm，5 μm)和富集柱(200 μm×5 cm，5 μm)中的固定相均為Jupiter C18填料(5 μm，300 ?)。流動相A為H2O(含0.2%甲酸)，流動相B為乙腈(含0.2%甲酸和4.8%的H2O)。上樣量為10 μL，以300 nL/min的流速進行洗脫，梯度為：0～10 min(2% B)，10～40 min(2%～40% B)，40～45 min(40%～95% B)，45～48 min(95% B)。

1.2.3 質(zhì)譜檢測：洗脫的完整N-糖肽，用Q Exactive質(zhì)譜儀進行在線鑒定。離子傳輸管的溫度設定為280 ℃，噴霧電壓為2.8 kV，一級質(zhì)譜m/z采集范圍為700～2 000，質(zhì)量分辨率70 k(m/z 200)，自動增益控制(Automatic Gain Control，AGC)目標值為2×105，最大注射時間為50 ms；二級質(zhì)譜質(zhì)量分辨率設定為17.5 k，采用數(shù)據(jù)依賴性掃描模式(data-dependent acquisition，DDA)獲取強度前20的離子二級質(zhì)譜圖，設置高能碰撞誘導解離(higher-energy collisional dissociation，HCD)梯度碎裂能量依次為20%、30%和40%，AGC為5×105，最大注射時間為250 ms，隔離窗口寬度為3.0(m/z)，動態(tài)排除時間設定為20.0 s。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用GPSeeker蛋白質(zhì)及糖肽搜索軟件對上述采集到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行分析。篩選與參考文獻[11]在IIRPCs中鑒定到的相同蛋白質(zhì)作為本次研究的目標蛋白質(zhì)，依據(jù)文獻報道的方法[12]對這些蛋白質(zhì)和糖肽進行鑒定，其中糖基化殘基使用如下的單字母符號表示：巖藻糖，F(xiàn)；半乳糖，G；甘露糖，M；唾液酸，S。

2 結(jié)果

2.1 蛋白質(zhì)及其糖肽的鑒定

共鑒定了來自12種蛋白質(zhì)的89種糖肽(代表性質(zhì)譜圖見圖1)，其中28種糖肽(31.5%)來源于IgG2，17種(19.1%)來源于IgG1，17種(19.1%)來源于IgA2，11種(12.4%)來源于觸珠蛋白，5種(5.6%)來源于補體C4b，2種(2.2%)來源于補體C3，2種(2.2%)來源于凝血酶原，2種(2.2%)來源于觸珠蛋白相關蛋白，2種(2.2%)來源于β2-糖蛋白1(圖2A)。89種糖肽中，21種僅在慢性肺炎樣本中測出，38種僅在肺腺癌樣本中測出(圖2B)。

2.2 N-糖型結(jié)構(gòu)

N-糖型通常含有1個五糖核心，根據(jù)其末端單糖殘基的結(jié)構(gòu)特點可分為高甘露糖型、復雜型和雜合型。本研究篩選出的89種糖肽包含63種糖型，其中55種糖型為復雜型，5種為雜合型，3種為高甘露糖型。10種糖型僅在慢性肺炎樣本中測出，21種糖型僅在肺腺癌樣本中測出(圖3)。

A.mass spectrum of intact N-glycopeptide (glycoform: G0F) from IgG2 heavy chain at Asn176 site(black line: experimental isotopic peaks; red square: theoretical isotopic peaks); B.tandem mass spectrum of the intact N-glycopepetide; C.structure of intact N-glycopeptide including glycoform and sequence of amino acids

A.glycopeptide distribution of the detected proteins; B.glycopeptide distribution between lung cancer and lung pneumonia圖2 糖肽的來源和分布Fig 2 Source and distribution of the detected glycopeptides

2.3 N-糖基化修飾位點

免疫球蛋白IgG1、IgG2和IgG4重鏈Fc N-糖基化修飾位點分別為γ1的Asn180位點、γ2的Asn176位點和γ4的Asn177位點。免疫球蛋白IgA2的N-糖基化修飾的位點為Asn205。觸珠蛋白的N-糖基化修飾位點為Asn241。補體C4b的N-糖基化修飾位點分別為Asn226和Asn1328，補體C3的N-糖基化修飾位點為Asn85，補體C6的N-糖基化修飾位點為Asn324。凝血酶原的N-糖基化修飾位點為Asn121。觸珠蛋白相關蛋白的N-糖基化修飾位點為Asn126。β2-糖蛋白1的N-糖基化修飾位點為Asn162。血漿蛋白C1抑制因子的N-糖基化修飾位點為Asn238(圖4)。

圖4 糖蛋白質(zhì)的糖基化修飾結(jié)構(gòu)圖Fig 4 Structural diagram of the detected glycoprotein

2.4 疾病特異糖型

肺癌特異糖型(21種)中含有巖藻糖殘基的共18種， 占其總數(shù)的85.71%， 而慢性肺炎特異糖型(10種)中含有巖藻糖殘基的共8種，占其總數(shù)的80%。對肺癌，含有半乳糖殘基和唾液酸殘基的特異糖型分別為19種和10種，分別占其總數(shù)的90.48%和47.62%。對肺炎，含有半乳糖殘基和唾液酸殘基的特異糖型分別為5種和2種，分別占其總數(shù)的50%和20%(表1)。

表1 不同糖型所占百分比Table 1 Percentage of different glycoforms

慢性肺炎特異糖型中僅有2種單唾液酸化修飾糖型，而肺癌特異糖型中有6種單唾液酸化修飾糖型和4種雙唾液酸化修飾糖型。

2.5 同一糖基化位點上的糖型與病理類型

對肺炎，IgG1的Asn180位點可檢測到3種特有糖型，且均不含唾液酸殘基；對肺癌，該位點上可連接8種特有糖型，其中1種含有唾液酸殘基。IgG2的Asn176位點上在慢性肺炎中檢測到9種含有半乳糖殘基的特有糖型，在肺癌中僅檢測到4種含有半乳糖殘基的特有糖型。IgG4的Asn177位點上僅在慢性肺炎中檢測到1種糖型。

對慢性肺炎，IgA2的Asn205位點上僅連接2種特有糖型，對肺癌，可檢測到12種特有糖型。對慢性肺炎，觸珠蛋白的Asn241位點上可連接2種特有糖型，肺癌僅有1種。IgA2與觸珠蛋白的N-糖型大部分含有唾液酸殘基。

補體C4b的Asn226和Asn1328位點上各有1種慢性肺炎特有糖型。在肺癌中，補體C3的Asn85位點、凝血酶原的Asn121位點和β2-糖蛋白1的Asn162位點分別檢測到2種糖型，而在慢性肺炎中均未測出。觸珠蛋白相關蛋白的Asn126位點上連接的2種糖型僅出現(xiàn)在慢性肺炎中。血漿蛋白C1抑制因子的Asn238位點和補體C6的Asn324位點上各連接1種糖型，且僅出現(xiàn)在肺癌中。

2.6 同一種N-糖型連接的位點與病理類型

帶有一個半乳糖殘基的巖藻糖基化的糖型(G1F)連接在肺癌的IgG1上，而在慢性肺炎中它連接在IgG2上。帶有兩個半乳糖殘基的巖藻糖化的糖型(G2F)可以連接在肺癌的IgG1和IgG2上，但在慢性肺炎中僅發(fā)現(xiàn)連接在IgG2上。凝血酶原的Asn121位點、觸珠蛋白相關蛋白的Asn126位點與補體C4b的Asn1328位點均可連接2種糖型，分別為雙天線G2S2結(jié)構(gòu)與三天線G2S2結(jié)構(gòu)。對于凝血酶原，這2種糖型僅出現(xiàn)在肺癌中；對于觸珠蛋白相關蛋白，這2種糖型僅出現(xiàn)在慢性肺炎中；對于補體C4b，雙天線結(jié)構(gòu)G2S2僅出現(xiàn)在慢性肺炎中，三天線結(jié)構(gòu)G2S2在兩種病理狀態(tài)下均出現(xiàn)。

3 討論

不同蛋白質(zhì)N-糖基化修飾與疾病狀態(tài)密切相關，如血清IgG、觸珠蛋白、受體酪氨酸激酶和E-鈣黏蛋白等[6,13]。目前，大部分研究主要對總蛋白質(zhì)的N-糖基化修飾進行分析，對疾病特異蛋白質(zhì)糖基化修飾的研究較少[8-9]。分析疾病特異蛋白質(zhì)在病理狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)變化，對深入認識發(fā)病機制和區(qū)分良惡性疾病具有重要的臨床意義。

蛋白質(zhì)N-聚糖結(jié)構(gòu)的變化是由多種酶促反應介導[13]。與肺炎相比，復雜的肺癌疾病特異免疫炎性蛋白質(zhì)N-糖型可能表明肺癌涉及更加復雜的酶促反應。同一蛋白質(zhì)的特定N-糖基化修飾位點連接的不同糖型與疾病狀態(tài)和蛋白質(zhì)的功能調(diào)節(jié)相關[14]。與肺良性疾病相比，非小細胞肺癌的IIRPCs中觸珠蛋白Asn241位點的G2和G2S兩種糖型、Asn207/211位點的G2G3S糖型的表達顯著升高[9]，同時IgG核心巖藻糖基化修飾水平顯著升高[10]。與慢性肺炎相比，肺腺癌患者的血清IgG的N-糖基化修飾可能會使其更易于與Fcγ結(jié)合，介導相關免疫反應，這可能與IgG Fc N-半乳糖基化修飾可促進IgG與Fcγ受體之間的結(jié)合，導致抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用和補體依賴的細胞毒性作用改變有關[15]。

同一糖型連接在不同蛋白質(zhì)的N-糖基化修飾位點上，出現(xiàn)在不同的疾病狀態(tài)中，表明這種差異具有疾病特異性；同一糖型連接在同一蛋白質(zhì)的不同位點上也表現(xiàn)出疾病特異性[14]。因此，忽略糖型的連接位點或連接位點的特殊環(huán)境，單純從聚糖結(jié)構(gòu)探討疾病特異性具有一定的局限性。

綜上所述，基于native-PAGE凝膠電泳和HPLC-MS/MS法，首次對疾病特異免疫炎性蛋白質(zhì)N-糖型的結(jié)構(gòu)進行了鑒定，發(fā)現(xiàn)了一批具有疾病特異的糖蛋白質(zhì)及相關的糖型。但由于本研究樣本量較小，研究具有一定的局限性，后續(xù)將進行大樣本量的驗證研究。