周 杰，黃英輝

(陸軍軍醫(yī)大學(xué) 1.西南醫(yī)院 腫瘤科； 2.預(yù)防醫(yī)學(xué)院 復(fù)合傷研究所， 重慶 400038)

腫瘤是嚴(yán)重危害人類健康的重大疾病[1]。中國腫瘤病死率自2006年以來有所降低，但是仍然是中國居民重要的死亡原因，也是最主要的公共健康問題，全球腫瘤發(fā)病率和病死率也依然在快速增長(zhǎng)[1]。因此，對(duì)于腫瘤的發(fā)生發(fā)展，依然是值得廣大研究者不斷去深入探索的一個(gè)主題。

腫瘤發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素參與的過程，這個(gè)過程中包括了抑癌基因的失活、癌基因的異常激活、蛋白表達(dá)的空間時(shí)間發(fā)生紊亂等，而胞核-胞質(zhì)(nuclear-cytoplasmic translocation，簡(jiǎn)稱“核轉(zhuǎn)位”)轉(zhuǎn)位則在上述過程中扮演了重要的角色，最終導(dǎo)致腫瘤惡性程度高、治療效果差。因此，核轉(zhuǎn)位近年來也愈發(fā)受到廣大研究者的關(guān)注，如：對(duì)核轉(zhuǎn)位進(jìn)行調(diào)控可治療難治性肺癌；代謝調(diào)節(jié)酶PFKFB3的核轉(zhuǎn)位異?？纱龠M(jìn)糖酵解[2]等。因此，本文對(duì)核轉(zhuǎn)位通路的基本結(jié)構(gòu)、生物學(xué)功能及其調(diào)控機(jī)制進(jìn)行綜述，旨在

探索通過調(diào)控功能蛋白的核轉(zhuǎn)位而抑制腫瘤，將從一個(gè)新的角度探究腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制及其干預(yù)措施。

1 核轉(zhuǎn)位通路的基本結(jié)構(gòu)

真核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核被細(xì)胞核膜分隔開。細(xì)胞核內(nèi)的功能蛋白在胞質(zhì)中合成，經(jīng)過唯一的通道——核孔復(fù)合體(nuclear pore complex，NPC)進(jìn)入胞核，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡和基因表達(dá)調(diào)控等過程中發(fā)揮了重要作用[3]。小分子物質(zhì)可通過主動(dòng)擴(kuò)散在胞核胞質(zhì)之間移位，而大分子蛋白、復(fù)合物等則需要借助于核轉(zhuǎn)位受體介導(dǎo)的主動(dòng)運(yùn)輸。

1.1 核孔復(fù)合體

NPC又稱為核孔蛋白，為具有“分子篩”功能的孔狀結(jié)構(gòu)，鑲嵌于核膜，故命名為“核孔”。 NPC形狀類似于籃球網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)外各有8個(gè)球狀顆粒，核孔中央有一個(gè)中心顆粒，中心顆粒的細(xì)絲與16個(gè)球狀顆粒相互連接。NPC分子質(zhì)量為125 ku，由30余種高度保守的蛋白構(gòu)成，它能提供靶蛋白與核轉(zhuǎn)位受體的結(jié)合位點(diǎn)，使其通過NPC入核[4]。

1.2 核轉(zhuǎn)位信號(hào)

核轉(zhuǎn)位信號(hào)主要包括入核信號(hào)(nuclear localization signal，NLS)和出核信號(hào)(nuclear export signal，NES)。二者均為富含堿性氨基酸的肽段，一般不超過8～10個(gè)氨基酸。NLS通常分為兩類：4～7個(gè)氨基酸構(gòu)成的短基本序列，以及由兩個(gè)延伸的基本氨基酸序列組成的較長(zhǎng)的二部分序列，該序列由5～20個(gè)保守性較低的氨基酸隔開[5]。NES則大致符合以下序列Φ-X2-3-Φ-X2-3-Φ-X-Φ(Φ=L,I,V,F,M; X為任意氨基酸)[6]。靶蛋白需要具備核轉(zhuǎn)位信號(hào)才能被核轉(zhuǎn)運(yùn)受體識(shí)別，而攜帶核轉(zhuǎn)位信號(hào)并非一定就會(huì)發(fā)生核轉(zhuǎn)位。核轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)被覆蓋或者被修飾均會(huì)導(dǎo)致核轉(zhuǎn)位失敗[2,7]。

1.3 核轉(zhuǎn)運(yùn)受體

核轉(zhuǎn)運(yùn)受體Karyopherin是一種受體蛋白，與選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)密切相關(guān)。Karyopherin家族包括Karyopherin α和Karyopherin β[8]。Karyopherin β(Kapβ，importin/exportin)亞家族包含超過20個(gè)成員，發(fā)揮入核或出核轉(zhuǎn)運(yùn)的功能。Karyopherin β1(Kpnβ1)，又叫Importinβ，是主要的入核轉(zhuǎn)運(yùn)受體。而Karyopherin β亞家族中：CAS、染色質(zhì)區(qū)域維持因子1(chromosomal region maintenance 1，CRM1)、exportin-t、MSN5是目前已證明的參與出核的4種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。Karyopherin α(Kpn α)，又叫Importin α，是NLS的受體蛋白，其C端為NLS結(jié)合域，N端為Karyopherin β1結(jié)合域。Importin α與Importin β結(jié)合后形成Importin α/β異源二聚體，再識(shí)別貨物蛋白的NLS形成三聚體[8]。該三聚體通過NPC入核，從而完成經(jīng)典的核轉(zhuǎn)位過程。

2 核轉(zhuǎn)位通路介導(dǎo)的出入核機(jī)制

2.1 漿蛋白入核

胞質(zhì)-胞核轉(zhuǎn)運(yùn)通路(圖1)。經(jīng)典的核輸入過程：Karyopherin α/β1異源二聚體形成后，Karyopherin α識(shí)別含有NLS序列的貨物蛋白形成三聚體。該三聚體通過Karyopherin β1結(jié)合到NPC的胞質(zhì)面并與Ran-GDP結(jié)合形成復(fù)合體，在轉(zhuǎn)運(yùn)因子NTF2和核孔蛋白等的協(xié)助下入核[9]。胞核內(nèi)，在鳥苷酸交換因子RanGEF的作用下，Ran-GDP轉(zhuǎn)換為Ran-GTP導(dǎo)致三聚體構(gòu)象改變進(jìn)而將靶蛋白和Karyopherin α釋放到胞核。Karyopherin α再與胞核內(nèi)其他Ran-GTP結(jié)合，被出核受體凋亡易感性蛋白(cellular apoptosis susceptibility，CAS)攜帶出核。剩下Karyopherin β1與Ran-GTP的二聚體通過核孔復(fù)合體回到細(xì)胞質(zhì)。Ran-GTP在胞質(zhì)中水解為RanGDP，而CAS再通過NPC入核，如此循環(huán)反復(fù)[10]。

圖1 胞核-胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)通路示意圖[11]Fig 1 Schematic diagram of nuclear-cytoplasmic translocation pathway

2.2 核蛋白出核

在胞核內(nèi)，出核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與含有NES的靶蛋白、Ran-GTP直接結(jié)合，形成出核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-靶蛋白-RanGTP三聚體復(fù)合物，穿過NPC出核。在胞質(zhì)中，Ran-GTP活化蛋白(Ran-GTPase activating protein，Ran-GAP)與Ran結(jié)合蛋白(RanBP1)結(jié)合，將Ran-GTP去磷酸化成為Ran-GDP，靶蛋白被釋放。出核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白再經(jīng)NPC再次入核，從而完成靶蛋白的核質(zhì)轉(zhuǎn)位[10,12]。CRM1(又叫XPO1)作為Karyopherin β家族中最主要的出核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，介導(dǎo)超過200個(gè)核蛋白出核。更重要的是，它是幾類重要的腫瘤相關(guān)蛋白唯一的出核轉(zhuǎn)運(yùn)載體，包括：1)腫瘤抑制蛋白，如P53、P73、Rb、APC和BRCA1等。2)細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，如：p21、p27和Tob。3)免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)因子，如：NF-κB抑制因子，IκB。4)癌基因，如：BCR-ABL。

5)化療靶點(diǎn)，如拓?fù)洚悩?gòu)酶I和II[6]。因此，CRM1在腫瘤領(lǐng)域引起廣泛關(guān)注，其與結(jié)直腸癌、乳腺癌、多發(fā)性骨髓瘤等腫瘤發(fā)生密切相關(guān)[13]。

3 核轉(zhuǎn)位調(diào)控

3.1 蛋白出核抑制劑

目前蛋白出核抑制劑研究主要集中于CRM1，CRM1抑制劑能結(jié)合其Cys528殘基，進(jìn)而抑制其識(shí)別并結(jié)合含有NES區(qū)的靶蛋白。例如來普霉素B (Leptomycin B，LMB)，是第一個(gè)鑒定出來的CRM1特異性抑制劑，可與CRM1發(fā)生不可逆性結(jié)合，進(jìn)而抑制CRM1介導(dǎo)的靶蛋白出核，但是因毒性較大而未能應(yīng)用于臨床患者[14]。一系列的出核特異性抑制劑(selective inhibitors of nuclear export，SINE)，即KPT類水溶性化合物，包括KPT-127、KPT-185、KPT-214、KPT-251、KPT-276、KPT-330(Selinexor)和KPT-335(Verdinexor)等。SINE能與CRM1的活性氨基酸Cys528發(fā)生加成反應(yīng)，從而抑制CRM1介導(dǎo)的靶蛋白出核[13]。

3.2 蛋白入核抑制劑

Karyopherin β在多種腫瘤中高表達(dá)，而抑制其表達(dá)能顯著誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡；2016年Karyopherin β的特異性抑制劑INI-43[3-(1H-benzimidazol-2-yl)-1-(3-dimethylaminopropyl)被成功研發(fā)，通過抑制蛋白入核而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)[15]。芬維 A胺[N-(4-hydroxyphenyl)retinamide，4-HPR]能顯著抑制多種腫瘤，而且具有較小的副作用，因此備受研究人員青睞。目前，4-HPR作為抗腫瘤藥物已在多種腫瘤中開展I～I(xiàn)I期臨床實(shí)驗(yàn)，包括小細(xì)胞肺癌、前列腺癌、卵巢癌和惡性腦膠質(zhì)瘤等[16]。

3.3 靶蛋白修飾

核轉(zhuǎn)位對(duì)細(xì)胞生命活動(dòng)的調(diào)節(jié)具有重要作用，因此其轉(zhuǎn)位調(diào)控逐漸受到重視。近期研究主要集中在：對(duì)靶蛋白NLS區(qū)、NES區(qū)修飾，包括靶蛋白的磷酸化、甲基化、乙?；头核鼗?，使靶蛋白滯留于胞質(zhì)或胞核。例如：PFKFB3的乙?；蛊湓诎|(zhì)中蓄積，進(jìn)而促進(jìn)糖酵解，導(dǎo)致鉑耐藥[2]。Yes相關(guān)蛋白(Yes-associated protein，YAP)在多種腫瘤中高表達(dá)。YAP入核后能激活轉(zhuǎn)錄因子TEAD，促使下游癌基因轉(zhuǎn)錄和翻譯，進(jìn)而發(fā)揮促癌效應(yīng)。Hippo信號(hào)通路能磷酸化YAP，使其滯留于胞質(zhì)而抑制其活性，因而能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡[17]。

3.4 Ran的表達(dá)調(diào)控

Ran(a small nuclear GTP-binding protein)是Ras家族中的一員，是存在于真核細(xì)胞內(nèi)的小分子GTP酶。貨物蛋白的核質(zhì)運(yùn)輸離不開Ran的協(xié)助。Ran在Ran-GTP和Ran-GDP兩種構(gòu)像之間改變。在胞核內(nèi)Ran-GTP可以促使入核的靶蛋白從入核聚合物上解離下來，同時(shí)促進(jìn)出核復(fù)合物形成。在胞質(zhì)中Ran-GTP則是被水解為Ran-GDP。因而Ran-GTP存在胞核內(nèi)濃度高漿內(nèi)濃度低的分布特點(diǎn)，這種濃度的差異使核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)更具方向性。倘若Ran表達(dá)發(fā)生改變，勢(shì)必影響靶蛋白正常功能的發(fā)揮。

3.5 蛋白相互作用

調(diào)節(jié)蛋白的核質(zhì)分布，除了通過直接調(diào)節(jié)出入核轉(zhuǎn)運(yùn)受體外，還可以通過與穩(wěn)定存在于胞質(zhì)或胞核蛋白的相互作用實(shí)現(xiàn)[18]。一個(gè)含有NLS的蛋白，不能正常的通過核轉(zhuǎn)運(yùn)的方式進(jìn)入胞核。其中一個(gè)重要的原因在于其與穩(wěn)定表達(dá)于胞質(zhì)的蛋白緊密結(jié)合，這種結(jié)合將其NLS入核序列遮蓋。同樣，一個(gè)含有NES出核轉(zhuǎn)運(yùn)序列的蛋白滯留于胞核，也可能是由于與其他穩(wěn)定表達(dá)于胞核的相互作用導(dǎo)致其出核障礙。例如：核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)，主要在胞核內(nèi)發(fā)揮作用，然而，當(dāng)它在胞質(zhì)內(nèi)與Iκ-B結(jié)合時(shí)，NF-κB的NLS序列就會(huì)被遮蓋，導(dǎo)致其不能入核，進(jìn)而起到抑制腫瘤的作用[18]。

4 核轉(zhuǎn)位與腫瘤

4.1 核轉(zhuǎn)位與腫瘤的發(fā)生

腫瘤是一個(gè)基因的疾病，其發(fā)生的過程就是基因調(diào)控紊亂的過程，各種抑癌基因“不在其位而不謀其政”促使或加速了該過程的發(fā)生。其中比較經(jīng)典的當(dāng)屬抑癌基因P53的出核轉(zhuǎn)運(yùn)了，該蛋白主要在胞核內(nèi)通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控來實(shí)現(xiàn)抑癌作用，而其出核轉(zhuǎn)位直接影響了抑癌作用的發(fā)揮[19]。近年來，隨著科學(xué)家們對(duì)核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象認(rèn)識(shí)的逐漸加深，越來越多的核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象被發(fā)現(xiàn)，越來越多的腫瘤形成原因被揭露。值得注意的是，一些非癌基因或抑癌基因的的蛋白，由于核轉(zhuǎn)位的發(fā)生，產(chǎn)生了新的功能作用，并在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到了巨大的推動(dòng)作用。例如，在DNA損傷壓力下，胞質(zhì)DNA識(shí)別受體環(huán)鳥苷酸-腺苷酸合成酶(cyclic GMP-AMP synthase，cGAS)可以發(fā)生入核轉(zhuǎn)運(yùn)，并在核內(nèi)通過抑制細(xì)胞的同源重組(homologous recombination，HR)修復(fù)使得基因組不穩(wěn)定性增加，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[20]。因此，在對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展的認(rèn)識(shí)上，不應(yīng)該僅僅局限于基因的突變及蛋白量的改變上，充分意識(shí)到核轉(zhuǎn)位的作用可以使人們對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展認(rèn)識(shí)更加全面。

4.2 核轉(zhuǎn)位與腫瘤的治療

基因的核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象不僅在腫瘤的發(fā)生發(fā)展上占有舉足輕重的地位，針對(duì)于該現(xiàn)象的研究在腫瘤治療上也取得了令人振奮的成果。而目前針對(duì)于核質(zhì)轉(zhuǎn)位的治療主要集中在以CRM1為代表的核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白上。例如，CRM1的抑制劑selinexor在治療血液腫瘤上就取得了突破性進(jìn)展[13]，該抑制劑不僅于2019年7月3日被美國食品和藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)上市，更是被寫進(jìn)了NCCN指南。另外，在實(shí)體瘤的治療上，核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑也開始展露鋒芒。對(duì)于Kras基因突變的肺癌，一直以來都是無藥可靶向。而研究者卻發(fā)現(xiàn)抑制XPO1的selinexor會(huì)殺死依賴于Kras基因的肺癌細(xì)胞，這項(xiàng)發(fā)現(xiàn)可能會(huì)為難治性肺癌打開新世界的大門[21]。當(dāng)然，關(guān)于Selinexor的研究不僅僅限于血液腫瘤和肺癌，目前相關(guān)的臨床試驗(yàn)已在婦科腫瘤、腦癌、前列腺癌和頭頸癌等腫瘤中開展。相信在不久的將來，核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑會(huì)為腫瘤的治療史揭開新的篇章。

4.3 核轉(zhuǎn)位與腫瘤的耐藥

腫瘤的耐藥是腫瘤的治療過程中面臨的一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)，而腫瘤耐藥的發(fā)生也伴隨了各種蛋白核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象的發(fā)生。包括代謝相關(guān)蛋白的核轉(zhuǎn)位[2]、氧化還原相關(guān)蛋白核轉(zhuǎn)位[22]等，這些蛋白或基因的異常核質(zhì)定位從多個(gè)角度影響了化療藥物的敏感性。更加值得注意的是，核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象不僅發(fā)生在化療藥耐藥，同樣與靶向治療的耐藥也息息相關(guān)。例如，核蛋白激酶Cδ(PKCδ)作為多個(gè)已知TKI抗性機(jī)制共同軸，其核定位是TKI耐藥必須的，而TKI滅活的EGFR與涉及TKI抗性的其他膜受體二聚化可促進(jìn)PKCδ核轉(zhuǎn)位，進(jìn)而促使TKI耐藥的發(fā)生[23]。可以說核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象已經(jīng)滲入到腫瘤耐藥機(jī)制的方方面面。

5 問題與展望

腫瘤是基因的疾病，核轉(zhuǎn)位是基因異常表達(dá)的重要原因。目前針對(duì)基因的研究中，靶向基因的突變和過表達(dá)的藥已經(jīng)使腫瘤治療得到了質(zhì)的飛躍。而核轉(zhuǎn)位作為腫瘤中更為普遍的現(xiàn)象，發(fā)生在腫瘤的各階段，并參與各種生物學(xué)行為，與腫瘤的治療和耐藥息息相關(guān)。因此，靶向核轉(zhuǎn)位的治療存在著巨大的潛力，未來必將在腫瘤的治療史上留下濃墨重彩的一筆。然而，核轉(zhuǎn)位通路參與因素眾多、調(diào)控因子復(fù)雜，各因素間相互協(xié)同、制約，很難做到精準(zhǔn)靶向。目前針對(duì)于核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的抑制劑雖然能改變蛋白的核質(zhì)定位，但無法做到某一蛋白定位的精準(zhǔn)改變，這就造成了副作用大等弊端。但是，隨著對(duì)核質(zhì)轉(zhuǎn)位研究的不斷深入，以及基因技術(shù)的不斷成熟，高效性、特異性和低毒性的核轉(zhuǎn)位抑制劑有望成為惡性腫瘤的治療靶點(diǎn)。