楊屹立，何學(xué)元，潘新民，馬建勛

(甘肅省人民醫(yī)院 普外科, 甘肅 蘭州 730000)

miRNA是一類長度為18～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼小RNA，其通過與靶基因mRNA的3′-UTR特異性結(jié)合，導(dǎo)致靶基因mRNA降解或抑制翻譯過程進(jìn)而下調(diào)靶基因的表達(dá)，參與對細(xì)胞增殖、分化、凋亡及腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移等生理病理過程的調(diào)控[1]。miR-205-5p定位于1號染色體q32.2位置，已證實(shí)與鼻咽癌、結(jié)腸癌和腎上腺皮質(zhì)癌等多種惡性腫瘤的增殖轉(zhuǎn)移有關(guān)[2-4]。目前，尚未有miR-205-5p對胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲影響的相關(guān)研究。RAP2B在生物體內(nèi)是一種癌基因，其在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過程發(fā)揮重要作用[5]。Wnt/β-catenin信號通路與多種惡性腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[6-7]。因此，推測miR-205-5p可能通過介導(dǎo)RAP2B表達(dá)調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路，進(jìn)而影響胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。本研究探討了miR-205-5p和RAP2B對胃癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響，旨在為miR-205-5p作為胃癌的臨床治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS、MGC803、MKN-28、SGC-7901和正常胃黏膜細(xì)胞系GES-1(ATCC)；胎牛血清(杭州四季青公司)；青鏈霉素雙抗(HyClone公司)，DMEM和RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco公司)；LipofectamineTM2000相關(guān)轉(zhuǎn)染試劑和Trizol試劑(Invitrogen公司)；MTT試劑、DMSO試劑和Western blot相關(guān)試劑(北京索萊寶公司)；Transwell小室和Matrigel基質(zhì)膠(BD公司)；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒(Promega公司)；PCR引物、miR-con、miR-205-5p、si-con、si-RAP2B、pcDNA、pcDNA-RAP2B、MUT-RAP2B和WT-RAP2B的構(gòu)建、測序(上海生工公司)；RAP2B、cyclin D1、MMP-2和MMP-14抗體(Abcam公司)；β-actin、GSK-3β和β-catenin抗體(Santa Cruz公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和分組：用DMEM培基培養(yǎng)GES-1細(xì)胞，用RPMI-1640培養(yǎng)基分別培養(yǎng)AGS、MGC803、MKN-28和SGC-7901細(xì)胞，培養(yǎng)基內(nèi)均添加1%青鏈霉素雙抗、10%胎牛血清。培養(yǎng)條件：37 ℃、5% CO2、濕度飽和。當(dāng)細(xì)胞增殖至匯合度達(dá)到80%時(shí)，胰蛋白酶消化傳代。細(xì)胞轉(zhuǎn)染：利用LipofectamineTM2000將miR-con、miR-205-5p模擬物、si-con和si-RAP2B分別轉(zhuǎn)染至匯合度約為50%的AGS，24～48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。為進(jìn)一步驗(yàn)證miR-205-5p是通過下調(diào)RAP2B表達(dá)來調(diào)控AGS細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲的，在AGS細(xì)胞中同時(shí)轉(zhuǎn)入miR-205-5p模擬物和pcDNA-RAP2B，檢測AGS細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力變化。實(shí)驗(yàn)分組如下：對照組(正常培養(yǎng)的AGS細(xì)胞)、miR-con組(轉(zhuǎn)染miR-con)、miR-205-5p組(轉(zhuǎn)染miR-205-5p 模擬物)、si-con組(轉(zhuǎn)染si-con)、si-RAP2B組(轉(zhuǎn)染si-RAP2B)、miR-205-5p+pcDNA組(miR-205-5p和pcDNA共轉(zhuǎn)染)和miR-205-5p+pcDNA-RAP2B組(miR-205-5p和pcDNA-RAP2B共轉(zhuǎn)染)。

1.2.2 RT-qPCR檢測miR-205-5p和RAP2B mRNA的表達(dá):利用Trizol試劑分別提取正常胃黏膜細(xì)胞GES-1、胃癌細(xì)胞MGC803、MKN-28、SGC-7901和各組AGS細(xì)胞的總RNA，并檢測其濃度和純度。利用反轉(zhuǎn)錄酶將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-205-5p和RAP2BmRNA的相對表達(dá)量，分別以U6和β-actin為內(nèi)參。引物序列如下：miR-205-5p-F：5′-TCCTT CATTCCACCGGAGTCTG-3′，miR-205-5p-R：5′-GCG AGCACAGAATTAATACGAC-3′;U6-F：5′-ATTGGA ACGATACAGAGAAGATT-3′，U6-R：5′-GGAACGCTT CACGAATTTG-3′;RAP2B-F：5′-GACGTCGGCCAA AAACAAA-3′，RAP2B-R：5′-CGCACGATCTCGGCA AAT-3′;β-actin-F：5′-TATGCTCTCCCTCACGCCA-3′；β-actin-R：5′-TTTACGGATGTCAACGTCACAC-3′。

1.2.3 雙熒光素酶報(bào)告基因的檢測：利用生物信息軟件預(yù)測miR-205-5p的靶基因。發(fā)現(xiàn)miR-205-5p與WT-3′UTR-RAP2B能夠特異性結(jié)合，猜測RAP2B是miR-205-5p的靶基因，并利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測進(jìn)行驗(yàn)證。構(gòu)建野生型WT-RAP2B和突變型MUT-RAP2B的RAP2B-3′UTR熒光素酶報(bào)告基因載體，利用LipofectamineTM2000將miR-205-5p模擬物和miR-con分別與WT-RAP2B和MUT-RAP2B共轉(zhuǎn)染AGS細(xì)胞，將各組細(xì)胞置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒對各組AGS細(xì)胞的熒光素酶活性進(jìn)行測定。

1.2.4 MTT法檢測細(xì)胞活力：將各組細(xì)胞按照2×103個(gè)/孔，200 μL/孔接種于96孔板，分別于培養(yǎng)后0、24、48和72 h時(shí)間點(diǎn)向每孔中加入MTT試劑20 μL，繼續(xù)孵育4 h，小心吸去孔內(nèi)上清，每孔再加入150 μL的DMSO試劑，繼續(xù)孵育2 h，待結(jié)晶充分溶解后，用酶標(biāo)儀在490 nm波長處檢測各孔的A值(用空白孔進(jìn)行調(diào)零)，并繪制細(xì)胞活力曲線。

1.2.5 Transwell小室法檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力：遷移實(shí)驗(yàn)，取轉(zhuǎn)染48 h的各組AGS細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后離心收集細(xì)胞，用無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度。向Transwell下室加入500 μL含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，向上室加入300 μL(約5×104個(gè)細(xì)胞)的細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24 h，棉簽輕柔擦去上室膜上的細(xì)胞，甲醇固定下室膜30 min。晾干后，0.1%的結(jié)晶紫溶液染色20 min。洗去多余的染液后，于顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)不同視野觀察細(xì)胞，記錄細(xì)胞總數(shù)，并進(jìn)行拍照，取均值即為遷移細(xì)胞數(shù)目。

侵襲實(shí)驗(yàn)：采用包被基質(zhì)膠的Transwell小室，其他步驟同體外遷移實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 Western blot檢測細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及Wnt/β-catenin信號通路下游相關(guān)蛋白的表達(dá)：利用RIPA裂解液裂解各組AGS細(xì)胞，獲得各組細(xì)胞總蛋白，用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。沸水浴3～5 min使細(xì)胞充分變性，取20～30 μg已變性的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，電泳結(jié)束后，常規(guī)濕法將已分離的細(xì)胞蛋白從PAGE膠轉(zhuǎn)至PVDF膜，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用5%脫脂牛奶室溫?fù)u床封閉30 min，吸盡封閉液后，用Western blot洗滌液洗膜3次，每次10 min，然后加入已稀釋的抗RAP2B、β-actin、cyclin D1、MMP-2、MMP-9、GSK-3β和β-catenin蛋白的一抗，室溫孵育2 h后，向已洗滌后的PVDF膜中加入稀釋好的二抗，繼續(xù)室溫孵育1 h，ECL顯影后進(jìn)行拍照，并用Image J軟件對目的條帶進(jìn)行定量(以β-actin為內(nèi)參)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 正常胃黏膜細(xì)胞和胃癌細(xì)胞中miR-205-5p和RAP2B的表達(dá)

與正常胃黏膜細(xì)胞GES-1相比，胃癌細(xì)胞AGS、MGC803、MKN-28和SGC-7901中miR-205-5p的表達(dá)顯著降低，RAP2BmRNA和RAP2B蛋白的表達(dá)顯著升高(P<0.05)(圖1)。

A.expression level of miR-205-5p in gastric cancer cells; B,C.expression level of RAP2B in gastric cancer cells; *P<0.05 compared with GES-1

2.2 過表達(dá)miR-205-5p對AGS細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

與NC組和miR-con組相比，miR-205-5p組AGS細(xì)胞miR-205-5p的表達(dá)顯著降低(圖2A)。與NC組和miR-con組相比，miR-205-5p組AGS細(xì)胞在48和72 h時(shí)細(xì)胞活力顯著降低，AGS細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)目顯著減少，增殖相關(guān)蛋白cyclin D1和遷移侵襲相關(guān)蛋白MMP-2、MMP-9的表達(dá)均顯著減少(P<0.05)(圖2B～2E)。

2.3 抑制RAP2B表達(dá)對AGS細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

與NC組和si-con組相比，si-RAP2B組AGS細(xì)胞RAP2BmRNA和RAP2B蛋白的表達(dá)顯著減少(圖3A，D)(P<0.05)。與NC組和si-con組相比，si-RAP2B組AGS細(xì)胞在48和72 h時(shí)細(xì)胞活力顯著降低(圖3B)，AGS細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)目顯著減少(圖3E)，增殖相關(guān)蛋白cyclin D1和遷移侵襲相關(guān)蛋白MMP-2、MMP-9的表達(dá)均顯著減少(圖3C，D)(P<0.05)。

2.4 miR-205-5p靶向調(diào)控RAP2B表達(dá)

miR-205-5p與RAP2B-3′UTR-WT之間存在特異性結(jié)合位點(diǎn)(圖4A)。野生型RAP2B基因熒光素酶表達(dá)載體WT-RAP2B和miR-205-5p mimics共轉(zhuǎn)染AGS細(xì)胞后，miR-205-5p組AGS細(xì)胞熒光素酶活性較miR-con組明顯降低(P<0.05)；而突變型RAP2B基因熒光素酶表達(dá)載體MUT-RAP2B和miR-205-5p mimics共轉(zhuǎn)染AGS細(xì)胞后，miR-205-5p組AGS細(xì)胞熒光素酶活性較miR-con組差異不顯著(圖4B)。與miR-con組比較，miR-205-5p組AGS細(xì)胞RAP2B蛋白的表達(dá)量顯著減低；與anti-miR-con組比較，anti-miR-205-5p組AGS細(xì)胞RAP2B蛋白的表達(dá)量顯著升高(圖4C)(P<0.05)。

2.5 過表達(dá)RAP2B可部分逆轉(zhuǎn)過表達(dá)miR-205-5p對胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用

與miR-con組相比，miR-205-5p組AGS細(xì)胞在48 h和72 h時(shí)細(xì)胞活力顯著降低(圖5A)，AGS細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)目顯著減少(圖5D)，RAP2B、cyclin D1、 MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)均顯著減少(圖5B，C)(P<0.05)。與miR-205-5p+pcDNA組相比，miR-205-5p+pcDNA-RAP2B組AGS細(xì)胞在48和72 h時(shí)細(xì)胞活力顯著升高(圖5A)，AGS細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)目顯著增多(圖5D)，RAP2B、cyclin D1、MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)均顯著升高(圖5B，C)(P<0.05)。

A.the expression of miR-205-5p in gastric cancer cells; B.the effect of over-expression of miR-205-5p on the proliferation of gastric cancer cells; C，D.the effect of over-expression of miR-205-5p on the expression of cyclin D1, MMP-2 and MMP-9 in gastric cancer cells； E.over-expression of miR-205-5p affects migration and invasion of gastric cancer cells; *P<0.05 compared with NC group and miR-con group

A.the expression level of RAP2B in gastric cancer cells; B.the effect of knockout RAP2B on the proliferation of gastric cancer cells; C.the effect of RAP2B knockout on the migration and invasion of gastric cancer cells; D.knockout RAP2B on gastric cancer cells RAP2B, cyclin D1, MMP-2 and effect of MMP-9 expression; *P<0.05 compared with NC group and si-con group

A.bioinformatics software predicts the targeting relationship between miR-205-5p and RAP2B; B.dual luciferase reporter gene assay verifies the targeting relationship between miR-205-5p and RAP2B; C.Western blot detects the expression of RAP2B protein; *P<0.05 compared with the miR-con group; #P<0.05 compared with the anti-miR-con group

2.6 miR-205-5p通過調(diào)控RAP2B對Wnt/β-catenin信號通路下游相關(guān)蛋白GSK-3β和β-catenin表達(dá)的影響

與miR-con組相比，miR-205-5p組AGS細(xì)胞中β-catenin的表達(dá)顯著降低，GSK-3β的表達(dá)顯著升高(圖6)；與miR-205-5p+pcDNA組相比，miR-205-5p+ pcDNA-RAP2B組AGS細(xì)胞中β-catenin的表達(dá)顯著升高，GSK-3β的表達(dá)顯著降低(圖6)(P<0.05)。

3 討論

胃癌是全球?qū)е掳┗颊咚劳龅闹饕蛑?，了解胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制對臨床開展新的治療方法具有重大意義。miR-205-5p屬于miR-205簇成員之一，近年來，miR-205在人類多種疾病中的作用被廣泛報(bào)道。例如，miR-205-5p在垂體瘤中呈低表達(dá)，過表達(dá)miR-205-5p可有效抑制垂體瘤細(xì)胞的增殖和遷移[8]；miR-205-5p在前列腺癌中也呈低表達(dá)，過表達(dá)miR-205-5p可抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[9]。相反，miR-205在卵巢癌中表達(dá)增加，并促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的存活和侵襲[10]。RAP2B最早分離于人類血小板cDNA文庫，其編碼的RAP2B蛋白是Ras相關(guān)低分子量GTP結(jié)合蛋白超家族成員之一。RAP2B在多種腫瘤中呈高表達(dá)，并發(fā)揮促生存功能[11]。RAP2B在肺癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，并促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[12]。然而，miR-205-5p和RAP2B在胃癌中的表達(dá)情況及其對胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲的影響目前尚不清楚?；谝陨峡蒲斜尘?，便展開以下研究。

A,B.Western blot detected RAP2B, cyclin D1, MMP-2, MMP-9 protein expression; C.MTT detection of gastric cancer cell proliferation; D.Transwell detection of cell migration, invasion; *P<0.05 compared with miR-con group; #P<0.05 compared with the miR-205-5p+pcDNA-com group

*P<0.05 compared with miR-con group; #P<0.05 compared with the miR-205-5p+pcDNA-con group圖6 Western blot檢測Wnt/β-catenin信號通路下游相關(guān)蛋白GSK-3β和β-catenin表達(dá)

本研究首先對正常胃黏膜細(xì)胞和4種胃癌細(xì)胞中miR-205-5p和RAP2B的表達(dá)情況進(jìn)行檢測，結(jié)果證實(shí)miR-205-5p在胃癌細(xì)胞中表達(dá)顯著下調(diào)，RAP2B表達(dá)顯著上調(diào)。進(jìn)一步研究顯示，過表達(dá)miR-205-5p或抑制RAP2B表達(dá)均可抑制胃癌細(xì)胞AGS的增殖、遷移和侵襲，抑制cyclin D1、MMP-2和MMP-9表達(dá)。此外，雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和Western blot檢測證實(shí)，miR-205-5p可靶向負(fù)性調(diào)控RAP2B的表達(dá)。提示miR-205-5p通過靶向RAP2B抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。功能回復(fù)實(shí)驗(yàn)顯示，過表達(dá)RAP2B可反轉(zhuǎn)miR-205-5p對AGS細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲的抑制作用。Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)信號通路是生物進(jìn)化過程中比較保守的通路，糖原合成激酶3β(GSK-3β)是Wnt信號傳導(dǎo)途徑的關(guān)鍵酶，GSK-3β可促使β-catenin的磷酸化，β-catenin是Wnt信號通路中有轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的關(guān)鍵成員，其在胞質(zhì)內(nèi)的聚集可激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞增殖和侵襲異常，是Wnt信號通路激活的主要標(biāo)志[13-14]。本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-205-5p可抑制Wnt/β-catenin信號通路活化。過表達(dá)RAP2B可逆轉(zhuǎn)miR-205-5p對Wnt/β-catenin信號通路的抑制作用。以上結(jié)果提示，miR-205-5p通過靶向RAP2B抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，其機(jī)制可能與抑制Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)，這將是進(jìn)一步研究的重點(diǎn)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)miR-205-5p通過靶向RAP2B抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。因此，miR-205-5p有望成為胃癌臨床治療的潛在分子靶點(diǎn)。