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        納米HNS、TATB 及LLM?105 的RAW264.7 巨噬細(xì)胞毒性及其機(jī)制

        2020-08-10 06:43:50范美坤
        含能材料 2020年8期
        關(guān)鍵詞:納米級染毒細(xì)胞膜

        唐 燦,黃 兵,劉 柳,范美坤,周 陽

        (1. 中國工程物理研究院化工材料研究所,四川 綿陽 621999;2. 西南交通大學(xué)地球科學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院,四川 成都 611756)

        1 引言

        含能材料納米化以后表現(xiàn)出低壓長脈沖鈍感、高壓短脈沖敏感等獨(dú)特性能,以及在微型點(diǎn)火、起爆裝置及沖擊片雷管等方面展現(xiàn)出的廣闊應(yīng)用前景,受到了學(xué)者的關(guān)注[1-3]。但是,納米含能材料的生物安全問題卻鮮有報(bào)道。有資料顯示,梯恩梯(TNT)、黑索今(RDX)、泰安(PETN)等典型炸藥可以引起肝、腎、血液及神經(jīng)等組織器官毒性效應(yīng),并有致癌、致畸、致突變的潛在風(fēng)險(xiǎn)[4]。另外,流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn),環(huán)境中的超細(xì)納米顆粒一般比微米顆粒對人體健康造成危害更大[5],且尺寸越小,顯示出生物毒性的傾向越大[6-7]。

        納米化的TATB、HNS 和2,6?二氨基?3,5?二硝基吡嗪?1?氧化物(LLM?105)是含能材料領(lǐng)域最具有工業(yè)化應(yīng)用潛力的炸藥之一,其中超細(xì)HNS 已經(jīng)在常規(guī)武器中得到了大量應(yīng)用[1]。但目前關(guān)于TATB、HNS和LLM?105 生物毒性報(bào)道較少。Jorgenson 等[8]研究了常規(guī)粒徑TATB 對大鼠和小鼠的急性經(jīng)口毒性,得出半數(shù)致死劑量(LD50)>5 g·kg-1;同時(shí)還發(fā)現(xiàn)TATB對哺乳動物的皮膚和眼僅具有輕微且短暫的刺激作用。Yu 等[9]研究了LLM?105 對小鼠急性經(jīng)口毒性,發(fā)現(xiàn)小鼠的死亡率為10%~20%,其最小致死劑量為10%;對新西蘭兔進(jìn)行皮膚染毒,則未見異常。另外,大量研究已表明,納米材料的生物效應(yīng)與常規(guī)尺寸材料明顯不同,如微米銅粉被認(rèn)為是無毒的,但納米銅則可以顯著引起哺乳動物(H4LLE 和HepG2)和魚類(PLHC?1 和RTH?149)細(xì)胞毒性[10]。Chen 等人[6]實(shí)驗(yàn)得出納米氧化鋅的細(xì)胞毒性隨著粒徑的增加而降低,20,90,200 nm 的氧化鋅對HepG2 細(xì)胞的IC50分別為20.7,29.1,160 mg·L-1。Gandamalla 等[7]將 人 肺 細(xì)胞A549 暴露于不同粒徑二氧化鈦納米顆粒中,發(fā)現(xiàn)最小粒徑的顆粒引起的細(xì)胞毒性最大。以上研究表明材料的毒性與粒徑大小密切相關(guān)。遺憾的是,目前關(guān)于納米級TATB、HNS 和LLM?105 炸藥的毒性數(shù)據(jù)未見報(bào)道。

        鑒于材料納米化后不容忽視的生物毒性問題以及納米炸藥的應(yīng)用潛力,其對環(huán)境和人類的影響引起了廣泛的關(guān)注[11-13]。本研究選取小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7 細(xì)胞為受試對象,檢測納米級TATB、HNS和LLM?105 暴露后的細(xì)胞活性,獲得其細(xì)胞毒性與其暴露劑量之間的關(guān)系;并通過觀察細(xì)胞形態(tài)變化,表征乳酸脫氫酶、過氧化物歧化酶的活力、丙二醛含量的變化等,探究其對細(xì)胞的毒性作用機(jī)制。

        2 實(shí)驗(yàn)部分

        2.1 試劑與儀器2.1.1 主要試劑

        RAW264.7 巨噬細(xì)胞購自武漢普諾賽生物科技有限公司;DMEM 高糖培養(yǎng)基(Dulbecco's Modified Ea?gle's Medium)、胰酶均購自Hyclone 公司;南美胎牛血清購自CLARK 公司;CCK?8 試劑盒購自Biosharp 公司;乳酸脫氫酶、超氧化物歧化酶、丙二醛檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所;納米級HNS、TATB、LLM?105 來自中國工程物理研究院化工材料研究所。

        2.1.2 主要儀器

        ULTRA55 型場發(fā)射掃描電子顯微鏡(德國賽斯儀器公司);AE31 型倒置生物顯微鏡(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司);MCO?15AC 型二氧化碳培養(yǎng)箱(三洋電機(jī)國際貿(mào)易有限公司);壓力蒸汽滅菌器(上海宜川儀表廠);spectra max PLUS 384 型酶標(biāo)儀(美國Molecu?lar Devices 公司)。

        2.2 實(shí)驗(yàn)過程

        2.2.1 粒子表征

        取TATB、HNS、LLM?105 粉體于導(dǎo)電膠上,噴金處理后,掃描電鏡觀察。

        2.2.2 CCK?8 法檢測細(xì)胞活性

        取對數(shù)生長期的細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為6×104個(gè)·mL-1,接種于96 孔板,37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng),待細(xì)胞貼壁后,加入不同濃度培養(yǎng)基配制的HNS、TATB、LLM?105懸浮液,同時(shí)設(shè)置對照組。放入孵箱培養(yǎng)24 h 后,加200 μL 的CCK8 試劑,4 h 后測定450 nm 處的吸光度(D)。細(xì)胞存活率計(jì)算公式為:

        式中,D0為調(diào)零組吸光度;D1為實(shí)驗(yàn)組吸光度;D2對照組吸光度,單位均為L·(g·cm)-1。

        2.2.3 形態(tài)學(xué)表征

        取對數(shù)生長期的細(xì)胞,按照2.2.2 方法染毒24 h后,采用倒置顯微鏡和掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)改變。

        2.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)液上清LDH 活性檢測

        取對數(shù)生長期的細(xì)胞,按照2.2.2 方法染毒24 h后,收集細(xì)胞上清液,利用LDH 試劑盒測定LDH活力。

        2.2.5 細(xì)胞氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測

        取對數(shù)生長期的細(xì)胞,按照2.2.2 方法染毒24 h后,收集細(xì)胞用于SOD 活力、MDA 含量檢測,操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

        2.3 統(tǒng)計(jì)方法

        本實(shí)驗(yàn)所測細(xì)胞活性及相關(guān)酶活性均來自三組平行樣品,數(shù)據(jù)均以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,采用SPSS22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,并用單因素方差分析統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),P<0.05 表示差異顯著;P<0.01 表示差異極顯著。

        3 結(jié)果與討論

        3.1 材料表征

        三種納米級炸藥的掃描電鏡結(jié)果如圖1 所示,可見HNS、TATB、LLM?105 的平均粒徑大小分別是200,60,150~200 nm;形狀分別為矩形棒狀、圓球形、近球形。

        圖1 HNS、TATB、LLM?105 的掃描電鏡圖Fig.1 SEM image of HNS,TATB and LLM?105 particles

        3.2 細(xì)胞活性影響

        體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)常用于預(yù)測化學(xué)材料對生物體的毒性情況[14],常選取一些免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞等作為受試對象。巨噬細(xì)胞具有吞噬、清除異物的功能,在生物體的免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的防御作用[15-16],因此,研究納米顆粒對巨噬細(xì)胞的毒性效應(yīng),對預(yù)測納米顆粒的毒性十分重要。

        采用CCK?8 法測定了不同濃度下三種納米級炸藥染毒24 h 后的細(xì)胞活性,其結(jié)果列于表1。圖2 給出了細(xì)胞活性隨三種納米炸藥染毒濃度的演化關(guān)系??梢园l(fā)現(xiàn),RAW264.7 巨噬細(xì)胞活性隨三種炸藥濃度增加的變化趨勢相似,都呈現(xiàn)出明顯的劑量?效應(yīng)關(guān)系;但三者的毒性作用程度明顯不同。其中,LLM?105導(dǎo)致細(xì)胞活性下降最快,HNS 次之,TATB 最慢。例如,當(dāng)濃度為5 μg·mL-1時(shí),LLM?105 染毒組的細(xì)胞存活率為(56.5±3.97)%,而TATB 組的細(xì)胞存活率為(93.7±6.66)%;當(dāng)濃度達(dá)到最大的250 μg·mL-1時(shí),TATB 染 毒 組 的 細(xì) 胞 存 活 率 為(50.2±1.98)%,是LLM?105 組的細(xì)胞存活率(9.9±2.9)%的5~6 倍。依據(jù)圖2 的劑量?效應(yīng)關(guān)系,計(jì)算得出LLM?105、HNS、TATB 對RAW264.7 細(xì) 胞24 h 的 半 抑 制 濃 度(IC50)值分別為6.6,49.3,211.3 μg·mL-1,可知三種納米級炸藥對RAW264.7 細(xì)胞毒性強(qiáng)弱順序?yàn)長LM?105>HNS>TATB。目前最為廣泛接受的毒性機(jī)制包括 破 壞 細(xì) 胞 完 整 性[17]、氧 化 應(yīng) 激[18-20]、炎 癥 反應(yīng)[19-20]等,因此重點(diǎn)對細(xì)胞膜損傷和氧化應(yīng)激水平進(jìn)行了討論。

        表1 不同劑量水平上三種納米級炸藥對RAW264.7 細(xì)胞毒性比較(24 h 染毒,%)Table 1 The cytotoxicity comparison among three kinds of nano?scale explosives to RAW264.7 at different doses(24 h exposure,%)

        圖2 不同染毒劑量三種納米級炸藥對RAW264.7 細(xì)胞活力的影響Fig.2 Effects of three kinds of nano?scale explosives on RAW264.7 cell viability

        3.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

        采用倒置顯微鏡觀察RAW264.7 細(xì)胞的形態(tài)變化,結(jié)果如圖3 所示。對照組細(xì)胞形態(tài)呈圓形,有較小的足樣突起,細(xì)胞體積小,貼壁緊密,細(xì)胞密度較大,生長狀態(tài)良好(圖3a)。低濃度(5 μg·mL-1)TATB 與HNS 染毒組與對照組相比,細(xì)胞形態(tài)無顯著差異(圖3b 和3e),說明低濃度的TATB 與HNS 對細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能損害較小,細(xì)胞形態(tài)變化不明顯,這與CCK?8 細(xì)胞活性結(jié)果一致;而LLM?105 染毒細(xì)胞的數(shù)量減少明顯(圖3h)。當(dāng)濃度達(dá)到10 μg·mL-1時(shí),TATB 和HNS染毒細(xì)胞也開始出現(xiàn)細(xì)胞密度減小、細(xì)胞變長等變化(圖3f);LLM?105 染毒組部分細(xì)胞偽足消失,細(xì)胞呈長梭形,細(xì)胞數(shù)量顯著減少(圖3i);當(dāng)濃度達(dá)到100 μg·mL-1時(shí),各染毒組細(xì)胞皺縮變圓,細(xì)胞密度降低,間隙變大。以毒性最大的LLM?105 染毒細(xì)胞為例,掃描電鏡觀察了LLM?105 最高濃度下RAW264.7 細(xì)胞的微觀結(jié)構(gòu),可以清楚地看到細(xì)胞破碎及其碎片(圖4b),說明細(xì)胞膜受損嚴(yán)重??傮w來看,細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果基本上與細(xì)胞活性檢測結(jié)果一致。

        圖3 三種納米級炸藥染毒RAW264.7 細(xì)胞的形態(tài)變化(×400)Fig.3 Morphological changes of RAW264.7 cells infected with three kinds of nano?scale explosives(×400)

        圖4 LLM?105 顆粒(250 μg·mL-1)染毒RAW264.7 細(xì)胞的形態(tài)變化(SEM)(a. 對照組,b. 250 μg·mL-1 LLM?105 染毒RAW264.7 細(xì)胞組)Fig.4 Morphological changes of RAW264.7 cells infected with nano?LLM?105 particles(SEM)(a. control group,b. 250 μg·mL-1 LLM?105 infected with RAW264.7 cells)

        3.4 細(xì)胞膜滲透性影響

        乳酸脫氫酶(LDH)是一種胞漿酶,當(dāng)細(xì)胞膜受損或通透性增加時(shí)可泄漏至細(xì)胞外,故細(xì)胞培養(yǎng)液上清中LDH 活性的大小可反映細(xì)胞膜的損傷程度[21]。本實(shí)驗(yàn)測試的LDH 活性隨納米級炸藥濃度演化關(guān)系如圖5 所示。與對照組相比,染毒組的細(xì)胞上清液中LDH 活性均隨炸藥濃度增加而升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果說明,染毒后RAW264.7 細(xì)胞膜損傷程度有劑量依賴性,與本實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞活性的檢測結(jié)果及細(xì)胞形態(tài)變化相符。實(shí)際上,通過損傷細(xì)胞膜導(dǎo)致細(xì)胞死亡是納米材料細(xì)胞毒性的常見機(jī)制。如Kang 等[17]發(fā)現(xiàn)碳納米管是通過直接損傷細(xì)胞膜并導(dǎo)致細(xì)胞代謝能力下降和核酸外泄引起的細(xì)胞死亡。Kim 等[22]發(fā)現(xiàn)小鼠前成骨細(xì)胞暴露于銀納米顆粒48 h 后,細(xì)胞上清液中LDH 活性顯著增加。由此可見,受試細(xì)胞與納米材料接觸后,細(xì)胞膜的完整性遭到破壞是細(xì)胞死亡的重要原因。

        圖5 不同染毒劑量三種納米級炸藥對RAW264.7 細(xì)胞LDH 活力的影響(*P<0.05,**P<0.01)Fig.5 Effects of three kinds of nano?scale explos on RAW264.7 cell LDH activity

        3.5 細(xì)胞氧化應(yīng)激水平

        活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生及對生物體的毒害作用是迄今最為普遍接受的一種納米材料致毒機(jī)制[23]。過氧化物歧化酶(SOD)是直接參與分解體內(nèi)ROS 的主要抗氧化酶,可使超氧陰離子自由基歧化為過氧化氫和氧氣。SOD 活性的變化通常說明機(jī)體內(nèi)積累了過量的ROS,氧化還原平衡態(tài)失衡,誘發(fā)了氧化應(yīng)激效應(yīng)[24]。過量的ROS 會攻擊生物膜上的不飽和脂肪酸,造成氧化損傷,產(chǎn)生丙二醛(MDA)等代謝產(chǎn)物并在細(xì)胞內(nèi)積累[25]。因此通過這兩種指標(biāo)的變化,可以說明細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平。Jin[26]等發(fā)現(xiàn)隨TiO2納米顆粒濃度的增加,小鼠成纖維細(xì)胞中ROS 和LDH 的水平升高,而SOD 的活力下降。Ahamed[27]等發(fā)現(xiàn)Bi2O3納米顆粒能夠通過降低抗氧化劑含量(SOD)來調(diào)節(jié)細(xì)胞的氧化還原穩(wěn)態(tài)。也有研究指出細(xì)胞毒性與體內(nèi)誘發(fā)氧化應(yīng)激密切相關(guān),如Zeng[28]等指出氧化應(yīng)激早期為了處理過量ROS,SOD的合成量會上升,而當(dāng)抗氧化酶系統(tǒng)沒有能力處理過量的ROS 時(shí),SOD 的活力則會下降。

        圖6 結(jié)果顯示,經(jīng)HNS 暴露24 h 后,染毒組的細(xì)胞SOD 活力無明顯差異,不具備統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而TATB與LLM?105 染毒組與對照相比,各組細(xì)胞中SOD 活力隨染毒劑量的增加而呈下降趨勢,而其中LLM?105 細(xì)胞中SOD 活力下降更為顯著。SOD 活力下則意味著ROS 的清除能力受到抑制,過量的自由基可氧化生物膜的不飽和脂肪酸,使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受到損傷,從而降低細(xì)胞活性。正如圖7 所示,與對照組相比,LLM?105 染毒組可明顯引起細(xì)胞內(nèi)MDA 含量的升高,而TATB 和HNS 染毒組引起胞內(nèi)MDA 含量的變化不明顯。LLM?105 染毒組細(xì)胞MDA 含量的升高,表明細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物增多,SOD 活力下降可能與自由基的增多使抗氧化酶迅速被消耗有關(guān),這些結(jié)果說明LLM?105 造成細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生并積累了過量ROS,誘發(fā)了氧化應(yīng)激,進(jìn)而造成了氧化損傷。TATB 雖然引起SOD活力的下降,但是并未導(dǎo)致MDA 含量的明顯增加,說明TATB 對SOD 活力有輕微的抑制作用,未造成顯著的氧化損傷。本次實(shí)驗(yàn)過程中未檢測到HNS 染毒組引起細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng),由此可以得出細(xì)胞膜完整性的破壞可能是HNS 導(dǎo)致細(xì)胞活性下降的主要原因。LLM?105對細(xì)胞的氧化損傷效應(yīng)明顯強(qiáng)于TATB 和HNS,可能與分子結(jié)構(gòu)中的配位氧有關(guān)系,但這需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。

        圖6 不同染毒劑量三種納米級炸藥對RAW264.7 細(xì)胞內(nèi)SOD 活性的影響Fig.6 Effects of three kinds of nano?scale explosives on SOD activity in RAW264.7 cells

        圖7 不同染毒劑量三種納米級炸藥對RAW264.7 細(xì)胞內(nèi)MDA 含量的影響Fig.7 Effects of three kinds of nano?scale explosives on MDA content in RAW264.7 cells

        4 結(jié)論與展望

        (1)討 論 了 三 種 納 米 級 炸 藥HNS、TATB、LLM?105 對RAW 264.7 細(xì)胞的毒性效應(yīng),在實(shí)驗(yàn)濃度范圍和作用時(shí)間內(nèi),納米級HNS、TATB、LLM?105 對RAW264.7 細(xì)胞24 h 染毒的半抑制濃度分別為49.3,211.3,6.6 μg·mL-1,表明三種納米級炸藥具有明顯的細(xì)胞毒性作用,且呈劑量?效應(yīng)關(guān)系。

        (2)納米級HNS、TATB、LLM?105 導(dǎo)致細(xì)胞毒性的機(jī)制主要有兩方面,一是直接與細(xì)胞相互作用,可改變細(xì)胞形態(tài),破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整性,導(dǎo)致細(xì)胞死亡;二是納米TATB 和LLM?105 還可以引起細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng),進(jìn)而造成組織的氧化損傷,導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

        (3)僅探討了納米級HNS、TATB、LLM?105 的細(xì)胞尺度上的毒性效應(yīng),但納米材料的毒性評價(jià)需要針對同一種模型微生物以及動物,探究其在細(xì)胞、微生物和動物水平上的毒性效應(yīng);未來的研究應(yīng)繼續(xù)開展微生物以及動物水平的體內(nèi)毒性效應(yīng)實(shí)驗(yàn)研究,以便全面判斷三種納米級炸藥的生物毒性。

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