張守麗，陸夢琪，劉俊慧，俞玥*，董燕軍

（1.湖州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江湖州 313000；2.江蘇科技大學(xué)糧食學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212004；3.浙江工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江紹興 312000）

現(xiàn)代生活的高能量密度膳食結(jié)構(gòu)中脂肪攝入過多，致使體內(nèi)能量代謝旺盛，細胞代謝副產(chǎn)物活性氧（Reactive oxygen species，ROS）增加可誘發(fā)機體氧化應(yīng)激，嚴重威脅人類健康[1-4]?，F(xiàn)有研究表明，植物來源的天然抗氧化物質(zhì)能夠有效干預(yù)氧化應(yīng)激，減少有害副產(chǎn)物ROS 的產(chǎn)生，對于抑制氧化應(yīng)激損傷及其相關(guān)疾病的預(yù)防具有重要意義[5-6]。

植物黃酮類是最基本的植物天然抗氧化劑。黃酮類膳食補充劑的攝入有助于維持和促進人體生理健康[7-9]。谷物黃酮和豆科黃酮醇處理細胞，可以對由脂質(zhì)體刺激引起的細胞炎癥產(chǎn)生協(xié)同抗炎反應(yīng)[10]。Barreca 等[11-13]的研究也證實柑橘汁（Citrus sinensis Osbeck）以及川陳皮素中的黃酮類化合物具有良好的抗氧化活性。食品原料竹葉黃酮提取物因其良好的抗氧化、抗菌、消炎、抗心血管疾病等生物活性，引起廣泛關(guān)注[14-15]。動物試驗研究顯示，竹葉黃酮可以通過抑制TLR4 的表達和鈍化NF-kB 和MARK 通路來減弱炎性腸病[16]。補充富含葒草苷的竹葉黃酮提取物可以通過改善中樞氧化應(yīng)激對小鼠產(chǎn)生抗抑郁作用[17]。竹葉黃酮能通過降低機體ROS水平，改善線粒體功能障礙和阿爾茨海默癥小鼠的認知功能障礙[18]。

目前，竹葉黃酮提取物作為食品添加劑得到了大量關(guān)注，然而，其對高脂膳食引起的機體氧化應(yīng)激干預(yù)作用的相關(guān)報道較少，亟需開展相關(guān)研究以揭示竹葉黃酮提取物對高脂膳食引起的細胞氧化應(yīng)激狀態(tài)的影響，為相關(guān)功能食品的開發(fā)及利用提供理論支持。本項目在前期研究的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了油酸損傷HepG2 細胞模型，以富含黃酮化合物的竹葉粗提物為干預(yù)材料，通過測定干預(yù)前后甘油三酯（TG）、乳酸脫氫酶（LDH）、丙二醛（MDA）的含量，并利用流式細胞技術(shù)探究竹葉黃酮粗提物對油酸誘導(dǎo)的細胞ROS 水平升高的緩解作用，研究竹葉黃酮提取物對油酸引起的細胞損傷的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

1.1.1 材料與試劑

HepG2 細胞株購于上海生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所。胎牛血清培養(yǎng)基及0.25%胰蛋白酶購于Gibco 公司（Hyclone，Logan，UT，USA）；兒茶素、MTT 試劑與油酸購自Sigma 公司，細胞培養(yǎng)皿購于上海生工生物有限公司；竹葉黃酮粗提物，浙江圣氏生物科技有限公司（湖州）；DCFH-DA 細胞ROS 測試試劑盒，S0033，上海碧云天生物科技有限公司；甘油三酯（TG）、乳酸脫氫酶（LDH）、丙二醛（MDA）試劑盒，購于南京建成生物工程有限公司（南京）；其他試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

美國Eppendorf 離心機、生物安全柜、移液器；日本Sanyo MCO-15AC CO2恒溫培養(yǎng)箱；日本Olympus IX51倒置顯微鏡；美國Bioteck Synergy H2 多功能酶標儀等。

1.2 細胞復(fù)蘇與培養(yǎng)

參照Huang 等[19]的細胞培養(yǎng)方法略做修改。液氮中的HepG2 細胞經(jīng)37 ℃溫育解凍，轉(zhuǎn)移到5 mL 的離心管中，室溫1200 r/min 離心3 min 并棄上清，用完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清+1%雙抗）懸浮細胞后接種到培養(yǎng)皿中，輕輕吹打混勻，飽和濕度條件下培養(yǎng)（37 ℃、5%CO2）。經(jīng)傳代后取對數(shù)期的細胞進行后續(xù)試驗。

1.3 油酸模型的確立

試驗設(shè)置對照組、無細胞空白組、0.1 mmol/L 油酸干預(yù)組、0.2 mmol/L 油酸干預(yù)組、0.4 mmol/L 油酸干預(yù)組5個處理，對數(shù)期的細胞培養(yǎng)12、24、36 h 后，經(jīng)MTT 測試細胞的存活率后，采用試劑盒測試細胞TG、LDH 含量，以確定油酸模型的油酸處理濃度及培養(yǎng)時間。

1.4 試驗設(shè)計

復(fù)蘇后處于對數(shù)生長期的HepG2 細胞經(jīng)胰酶消化后，用培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度至5×104mL-1，并接種到96微孔板，采用不同培養(yǎng)液培養(yǎng)不同時間后測試其生化指標。試驗設(shè)置對照組、無細胞對照組、油酸處理組、竹葉黃酮干預(yù)組。

油酸24 h 組：按照0.1、0.2、0.4 mmol/L 的濃度將油酸加到微孔板中，培養(yǎng)24 h。

油酸12 h+正常12 h 組：按照0.1、0.2、0.4 mmol/L 的濃度將油酸加到微孔板中，培養(yǎng)12 h；除去油酸后，再加入細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)12 h。

油酸12 h+竹葉黃酮12 h 組：按照0.1、0.2、0.4 mmol/L的濃度將油酸加到微孔板中，每孔加入120 μg/mL 的竹葉黃酮提取物進行培養(yǎng)。每組重復(fù)3 次。

對照組為細胞培養(yǎng)24 h（不添加油酸和竹葉黃酮提取物），無細胞空白組只添加培養(yǎng)液，測試時作為背景予以扣除。

1.5 MTT 測試

細胞培養(yǎng)12、24、36 h 后，每孔加入10 μL 的MTT溶液，37 ℃培養(yǎng)4 h 并去掉培養(yǎng)基后，加入DMSO 溶液振蕩10 min，利用酶標儀測定570 nm 處的吸光度值。

1.6 生化指標的測試

LDH 可以催化乳酸生成丙酮酸的反應(yīng)，且可以透過損傷的細胞膜進入培養(yǎng)液，因此細胞培養(yǎng)液中LDH 的含量越高，表明細胞發(fā)生的氧化損傷越嚴重[20]。TG 含量是細胞出現(xiàn)脂肪肝損傷的重要指標[21]。MDA 含量被認為是細胞是否發(fā)生脂質(zhì)過氧化的一個重要指標[22]。LDH 采用2,4-二硝基苯肼法測試，TG 采用甘油磷酸氧化酶法（GPO-PAP 法）測試，MDA 采用硫代巴比妥酸法測試，具體測試步驟參考試劑盒的說明書執(zhí)行。

1.7 流式細胞儀測試ROS 水平

根據(jù)1.3 油酸模型結(jié)果，確認油酸損傷模型的油酸濃度、培養(yǎng)時間，以及竹葉黃酮提取物的干預(yù)濃度后，設(shè)置不同的試驗組進行細胞培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，用0.25%的胰酶溶液消化細胞，1200 r/min 離心3 min 后，沉淀復(fù)懸于PBS 溶液進行2～3 次清洗?；钚匝醯臋z測按照DCFH-DA 細胞ROS 測試試劑盒的操作說明進行，即在去除PBS 后，用無血清培養(yǎng)基稀釋DCFH-DA，陰性對照加不含DCFH-DA 探針的培養(yǎng)基溶液。37 ℃溫育20 min，中間5 min 渦旋一次。溫育結(jié)束后，經(jīng)無血清的培養(yǎng)基洗滌細胞2～3 次后，利用流式細胞儀進行檢測。

1.8 統(tǒng)計分析

應(yīng)用SPSS19.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，采用Oneway ANOVA 程序進行單因素方差分析。結(jié)果以“平均值±標準差”的形式表示，P<0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 油酸模型的建立

利用不同濃度的油酸進行細胞培養(yǎng)后，采用MTT 法測試細胞的存活情況，結(jié)果如圖1 所示。結(jié)果顯示，采用0.1、0.2、0.4 mmol/L 三個濃度的油酸分別培養(yǎng)HepG2 細胞12、24、36 h 后，與對照組比較發(fā)現(xiàn)，0.1 mmol/L 的油酸與對照組在處理時間里不存在顯著差異（P>0.05）。0.2 mmol/L 油酸干預(yù)組培養(yǎng)12 h 和24 h 時，細胞的存活率下降，但不顯著；在培養(yǎng)36 h 時，細胞的存活率顯著下降，與對照組存在顯著性差異（P<0.05）。而采用0.4 mmol/L 油酸干預(yù)時，培養(yǎng)12 h 就對細胞的存活率產(chǎn)生了顯著的影響。

結(jié)合TG 和LDH 的含量變化（圖2，見下頁）發(fā)現(xiàn)，在使用油酸培養(yǎng)HepG2 細胞時，與對照組相比，不同濃度的油酸（0.1、0.2、0.4 mmol/L）均可對細胞的TG 及LDH水平產(chǎn)生顯著的影響（P<0.05），可以用于油酸模型的構(gòu)建。結(jié)合油酸對細胞存活率影響的MTT 試驗結(jié)果，油酸模型的濃度定義為0.2 mmol/L 且培養(yǎng)時間為24 h。同時，根據(jù)前期研究結(jié)果顯示，120 μg/mL 的竹葉黃酮提取物（總黃酮含量為78.29±0.31 mg/g 干物質(zhì)，以兒茶素計）不對細胞的存活率產(chǎn)生顯著影響（P>0.05），后續(xù)干預(yù)試驗采用此濃度進行氧化應(yīng)激的干預(yù)研究。

2.2 不同處理對HepG2 細胞TG 水平的影響

研究顯示，高脂膳食地攝入可以使細胞內(nèi)TG 含量大量積累，導(dǎo)致肝損傷[23]。也有研究表明，油酸可以通過誘導(dǎo)線粒體功能障礙加劇氧化損傷[24]。在本試驗中，不同處理對HepG2 細胞TG 水平的影響見圖3，由圖3 可知，油酸培養(yǎng)導(dǎo)致HepG2 細胞出現(xiàn)嚴重的TG 積累，達到0.92 mmol/L。相比于油酸24 h 組，油酸12 h+竹葉黃酮12 h 組的TG 含量為0.58 mmol/L，出現(xiàn)顯著下降（P<0.05），下降了37%；同時顯著低于油酸12 h+正常12 h組TG 水平（P<0.05）。結(jié)果表明，竹葉黃酮提取物干預(yù)可以有效地降低HepG2 的TG 水平，有助于減輕油酸對HepG2 細胞的氧化損傷。

2.3 不同處理對HepG2 細胞LDH 水平的影響

不同處理對HepG2 細胞LDH 水平的影響如圖4 所示，由圖可知，油酸培養(yǎng)導(dǎo)致HepG2 細胞出現(xiàn)嚴重的LDH 積累，遠遠高于對照組的LDH 含量。相較于油酸24 h 組，油酸12 h+竹葉黃酮12 h 組的LDH 含量為110.5 U/L，出現(xiàn)顯著下降（P<0.05），下降了34%；同時顯著低于油酸12 h+正常12 h 組的LDH 水平（P<0.05）。結(jié)果表明，油酸誘導(dǎo)的細胞培養(yǎng)液中LDH 的含量升高，表明細胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，竹葉黃酮提取物的干預(yù)可以有效地降低HepG2 的LDH 水平，有助于減輕HepG2 細胞的氧化損傷。

2.4 不同處理對HepG2 細胞MDA 含量的影響

MDA 是細胞內(nèi)自由基與脂質(zhì)作用發(fā)生脂質(zhì)過氧化后的終產(chǎn)物，可以對蛋白質(zhì)和核酸產(chǎn)生影響，具有一定的生理毒性[25]。如圖5 所示，隨著培養(yǎng)時間的延長，油酸24 h組的細胞MDA 水平出現(xiàn)顯著增加，遠大于其他處理組（P<0.05）。油酸12 h+正常12 h 組較之于油酸24 h 組，MDA水平出現(xiàn)顯著回落。油酸12 h+竹葉黃酮12 h 組細胞的MDA 水平顯著降低，與油酸12 h+正常12 h 組、油酸24 h組相比，分別降低了19%和49%。細胞的MDA 水平在油酸誘導(dǎo)前后及竹葉黃酮提取物干預(yù)前后的變化顯示，油酸誘導(dǎo)可以顯著提升細胞內(nèi)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致細胞損傷，而竹葉黃酮提取物的干預(yù)則可以有效地降低脂質(zhì)過氧化水平，減輕由油酸帶來的氧化應(yīng)激，有助于維持細胞的健康狀態(tài)。

2.5 流式細胞儀測試ROS 水平

采用流式細胞儀并使用DCFH-DA 探針檢測ROS的含量水平如圖6 所示，由圖可知，油酸24 h 組ROS 水平顯著高于對照組（P<0.05）。相較于油酸24 h 組的HepG2 細胞，油酸12 h+正常12 h 組可以顯著地降低ROS 水平（P<0.05）；油酸12 h+竹葉黃酮12 h 組的ROS水平也顯著下降（32%），且顯著低于油酸12 h+正常12 h組。結(jié)果表明，竹葉黃酮提取物有效地減輕了油酸誘導(dǎo)導(dǎo)致的HepG2 細胞ROS 水平升高。細胞上清TG 含量的變化與細胞ROS 水平的變化共同揭示了油酸對HepG2的氧化損傷作用，并證實了竹葉黃酮提取物可以有效的削弱或者減輕這種氧化損傷。

現(xiàn)有研究表明，細胞內(nèi)的ROS 水平與多種信號通路的調(diào)控有關(guān)[26-27]。同時，細胞內(nèi)部的ROS 水平也是評價細胞損傷是否發(fā)生的重要信號[28]。ROS 的穩(wěn)定來自于ROS的產(chǎn)生與清除之間的動態(tài)平衡，本研究顯示，竹葉黃酮提取物干預(yù)后，細胞的ROS 水平顯著下降（P<0.05），有利于維持細胞內(nèi)正常的ROS 水平，維持細胞的正常生理穩(wěn)態(tài)，也有助于減輕油酸誘導(dǎo)導(dǎo)致的ROS 水平的過度升高。經(jīng)竹葉黃酮干預(yù)后，細胞的ROS 水平并沒有下降到對照組的水平，而是略高于對照組，這也表明，適度升高的ROS 水平，也有助于提升細胞的抗氧化應(yīng)答，促使細胞產(chǎn)生更多的抗氧化物質(zhì)，使其快速恢復(fù)正常穩(wěn)態(tài)[27]。

3 結(jié)論

機體內(nèi)的自由基含量過多時可以引起氧化損傷，使細胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。天然植物有效成分可以有效清除體內(nèi)自由基，維持機體正常的生理活性。本文構(gòu)建了油酸誘導(dǎo)HepG2 細胞的氧化損傷模型，探究了竹葉黃酮提取物對油酸誘導(dǎo)氧化損傷細胞的干預(yù)水平。通過試驗得出，相較于對照組，竹葉黃酮提取物可以有效地降低細胞的TG、LDH、MDA、ROS 水平，這表明油酸能夠誘導(dǎo)細胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，且竹葉黃酮提取物對細胞氧化應(yīng)激狀態(tài)有良好的改善作用。本項目中竹葉黃酮提取物對細胞氧化損傷的干預(yù)作用研究有助于拓寬相關(guān)功能產(chǎn)品的開發(fā)及綜合利用。