朱麗偉，周 焱，蔡 芳，鄧 嬌，黃 娟，張曉娜，張錦閣，陳慶富*

1. 貴州師范大學蕎麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究中心，貴州 貴陽 550001 2. 貴州省農(nóng)業(yè)科學院蠶業(yè)(辣椒)研究所，貴州 貴陽 550009

引 言

蕎麥是蓼科蕎麥屬一年生草本植物，其儲存蛋白質(zhì)組分的氨基酸組成接近于聯(lián)合國糧農(nóng)組織推薦的標準營養(yǎng)蛋白，具有很高的食用價值和醫(yī)療保健作用，是重要的藥食兩用雜糧作物。γ-氨基丁酸(GABA)是一種非蛋白質(zhì)氨基酸，具有調(diào)節(jié)血壓與心率、 促進生長素分泌、 抗衰老等作用[1]。多年生苦蕎是貴州師范大學陳慶富團隊通過選擇雜交、 染色體加倍、 雜交和中間雜交等方法對多年生金蕎麥育種的成果，與栽培苦蕎相比，其植株健壯，籽粒飽滿大粒，營養(yǎng)物質(zhì)含量高，再生力強，收獲割刈后可再次生長，二次收獲[2]。研究團隊對多年生苦蕎父本金蕎麥的葉片蛋白質(zhì)、 GABA等物質(zhì)進行研究，發(fā)現(xiàn)其含量遠高于籽粒，且金蕎麥葉發(fā)酵茶可提高小鼠免疫功能，還具有防治急、 慢性炎癥的功能[3-4]，因此多年生苦蕎的葉片具有極高的開發(fā)價值。

近紅外光譜技術(shù)作為一種物理測試技術(shù)，具有無損、 測定速度快、 可同時測定幾個指標等優(yōu)點。目前蛋白質(zhì)的測定方法主要是凱氏定氮法，GABA的測定方法有色譜法和分光光度法，這些方法有預(yù)處理復(fù)雜、 耗時長、 污染環(huán)境等缺點，因此研究一種能簡便快速、 無污染測定蛋白質(zhì)和GABA含量的方法具有重要的現(xiàn)實意義。

目前，已有大量應(yīng)用近紅外光譜技術(shù)分析作物含水量、 淀粉、 蛋白質(zhì)等的研究報告[5-8]。郭慧敏等利用紅外技術(shù)建立的蕎麥籽粒蛋白質(zhì)預(yù)測模型，發(fā)現(xiàn)用多元散射校正預(yù)處理6 803.9～6 094.2 cm-1區(qū)段的光譜，建立模型最優(yōu)，其預(yù)測模型的決定系數(shù)為0.948 1，交叉驗證均方根為0.68[7]。陳龍等研究使用近紅外技術(shù)在線監(jiān)測γ-氨基丁酸制備過程，所建立模型的決定系數(shù)為86.32%[1]。目前，利用近紅外光譜法研究蕎麥葉片蛋白和GABA含量還未見報道。本文利用傅里葉變換近紅外漫反射光譜技術(shù)測定222份多年生苦蕎葉片的近紅外光譜，采用偏最小二乘回歸法對光譜數(shù)據(jù)進行分析，構(gòu)建蕎麥蛋白質(zhì)和GABA近紅外分析模型，為實現(xiàn)多年生苦蕎葉片蛋白質(zhì)和GABA含量的快速檢測提供參考。

1 實驗部分

1.1 材料

實驗用的材料為2018年春季采收的多年生苦蕎葉片。為了得到更具代表性的樣品，種植了多個遺傳性狀已穩(wěn)定的多年生苦蕎自交系，并于生長期多次采收不同部位葉片(上三葉，中三葉和下三葉)，采收后先放于鼓風干燥機中105 ℃殺青30 min，然后于80 ℃烘24 h。烘干后的葉片用高速粉碎機粉碎后過100目篩，待用。

1.2 方法

1.2.1 多年生苦蕎葉片光譜采集

采用德國布魯克光譜儀器公司生產(chǎn)的MPA傅立葉變換近紅外光譜儀，其分辨率設(shè)為4 cm-1，掃描范圍4 000～12 000 cm-1，掃描次數(shù)64次。采用漫反射掃描，每份葉片樣品分為3等份，分別掃描光譜后單獨存放。

1.2.2 多年生苦蕎葉片中蛋白質(zhì)含量測定

葉片中蛋白質(zhì)含量參照國家標準《GB/T 5511—2008谷物和豆類氮含量測定和粗蛋白含量計算凱氏定氮法》。

1.2.3 多年生苦蕎葉片中GABA含量測定

GABA的測定參考程勇杰等的方法[8]。先用酸水解法預(yù)處理樣品。準確稱取0.100 0 g葉片粉末，將稱好的試樣放于水解管，加入6 mol·L-1鹽酸15 mL，置液氮中冷凍5 min，接到真空泵抽真空后再吹入氮氣，重復(fù)3次后封口。在恒溫干燥箱中110 ℃水解24 h。取出冷卻，打開水解管，將水解液全部轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶，用去離子水定容，吸取濾液1 mL于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸干，用1 mL pH 2.2檸檬酸鈉緩沖液溶解，過濾后取上清液進行測定。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析與處理

采用中國農(nóng)業(yè)大學開發(fā)的CAUNIRS近紅外光譜分析軟件，利用定量偏最小二乘法建立多年生苦蕎葉片的蛋白質(zhì)和GABA定量分析模型。采用內(nèi)部交叉驗證方法，比較不同模型的決定系數(shù)(R2)、 校正標準差(SEC)和平均相對誤差(RSD)，選擇最佳模型。當RSD小于10%時表明建模效果良好，預(yù)測精度較高，建立的模型可用于實際檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 多年生苦蕎葉片蛋白質(zhì)和GABA的含量

采用化學方法所測樣品中蛋白質(zhì)平均值為164.00 mg·g-1，含量范圍是121.000～331.000 mg·g-1；GABA的平均值為2.489 mg·g-1，含量范圍是1.439～3.968 mg·g-1，基本涵蓋了葉片蛋白質(zhì)和GABA含量的變化范圍，且在比范圍內(nèi)分布比較均勻，具有代表性。剔除異常樣品后，剩余222份樣品建模(圖1和圖2)。

圖1 222份多年生苦蕎葉片蛋白質(zhì)含量Fig.1 Contents of protein inperennial buckwheat leaves in the 222 samples

圖2 222份多年生苦蕎葉片GABA含量Fig.2 Contents of GABA inperennial buckwheat leaves in the 222 samples

2.2 模型的建立

2.2.1 多年生苦蕎葉片近紅外光譜特征

圖3為222份多年生苦蕎葉片樣品的原始近紅外吸收光譜?？嗍w麥葉片中含有較多的蛋白質(zhì)和GABA，這些物質(zhì)分子中都有常見的C—H和N—H等含氫基團，在近紅外光譜區(qū)有強烈的吸收峰。由圖3可見，蕎麥葉片的近紅外光譜圖存在多處吸收峰，不同樣品的光譜性狀相似，但吸收峰強度不同。

圖3 222份多年生苦蕎葉片近紅外光譜疊加圖Fig.3 Near infrared spectra of 222 perennial buckwheat leaves power

2.2.2 光譜范圍的選擇

根據(jù)頻率不同，近紅外光譜可劃分為低頻、 合頻和高頻區(qū)，從圖3可看出，10 000 cm-1以外的光譜噪聲太大，因此建模時剔除此區(qū)。本試驗嘗試選擇4 000～5 000，4 000～6 000，4 000～7 000，4 000～8 000，4 000～9 000，4 000～10 000，5 000～9 000，5 000～8 000，8 000～10 000 cm-1九個譜區(qū)建立模型。建模樣本總數(shù)為222份，其中建模集樣本數(shù)為178，檢驗集樣本數(shù)為44。

建立蛋白質(zhì)的測定模型時，選擇4 000～6 000，4 000～7 000，4 000～8 000，4 000～9 000，4 000～10 000，5 000～8 000 cm-1譜區(qū)建模效果較好，建模集與檢驗集的決定系數(shù)均在90%以上，8 000～10 000 cm-1光譜區(qū)建模效果較差。九個譜區(qū)建模集和檢驗集的平均決定系數(shù)分別為93.46%和91.77%(表1)。學者們運用近紅外技術(shù)建立了測定稻米、 甘薯、 小麥蛋白質(zhì)含量的近紅外模型，發(fā)現(xiàn)不同作物選定的最佳光譜區(qū)有差異，不過均在4 000～10 000 cm-1范圍內(nèi)[9-11]。郭慧敏報道蕎麥面粉蛋白質(zhì)的近紅外優(yōu)化光譜區(qū)間均為6 803.9～6 094.2 cm-1，與本試驗中光譜區(qū)間部分重疊[7]。

表1 光譜區(qū)對近紅外模型預(yù)測結(jié)果的影響(蛋白質(zhì))Table 1 Influence of spectral range on NIR prediction results(protein)

建立GABA測定模型時，選擇4 000～9 000和4 000～10 000 cm-1譜區(qū)建模效果較好，建模集與檢驗集的決定系數(shù)均在90%以上，相對誤差均低于10%，5 000～9 000和8 000～10 000 cm-1光譜區(qū)建模時，建立模型的建模集與檢驗集的決定系數(shù)均低于85%，相對誤差高于10%，模型不可用。九個譜區(qū)建模集和檢驗集的平均決定系數(shù)分別為86.28%和84.35%(表2)。張艷哲等報道活性米GABA的特征光譜區(qū)間為918～1 045 nm(9 569～10 893 cm-1)[10]，與本試驗中GABA的光譜區(qū)間(4 000～10 000 cm-1)有部分重疊。

表2 光譜區(qū)對近紅外模型預(yù)測結(jié)果的影響(GABA)Table 2 Influence of spectral range on NIR prediction results(GABA)

2.2.3 建模樣品與檢驗樣品比例的選擇

為了進一步鑒定近紅外光譜分析法檢測蕎麥蛋白質(zhì)和GABA含量的可行性及穩(wěn)定性，隨機選擇不同比例的建模樣品和檢驗樣品，進行模型建立和驗證。結(jié)果表明，建模集與檢驗集樣品比例為4∶1時，所建模型的建模集與檢驗集決定系數(shù)均大于94%，效果較好。采用不同樣品建模，蛋白質(zhì)建模集的平均決定系數(shù)為93.55%，檢驗集的平均決定系數(shù)為92.18%，表明采用4 000～9 000 cm-1光譜范圍內(nèi)的近紅外光譜信息所建立的蕎麥葉蛋白質(zhì)含量測定模型穩(wěn)定可靠(表3)。

表3 建模樣品對近紅外模型預(yù)測結(jié)果的影響(蛋白質(zhì))Table 3 NIR prediction results of model for different samples(protein)

從表4可以看出，建模集與檢驗集樣品比例為3∶1和4∶1時，所建模型的建模集與檢驗集決定系數(shù)均大于91%，效果較好。采用不同樣品建模，GABA建模集的平均決定系數(shù)為88.51%，檢驗集決定系數(shù)平均為86.80%，表明采用4 000～10 000 cm-1光譜范圍內(nèi)的近紅外光譜信息所建立的蕎麥葉片GABA含量測定模型穩(wěn)定可靠(表4)。

表4 建模樣品對近紅外模型預(yù)測結(jié)果的影響(GABA)Table 4 NIR prediction results of model for different samples(GABA)

2.2.4 預(yù)處理方法的選擇

為了進一步提高模型的決定系數(shù)、 降低主成分數(shù)并驗證其穩(wěn)定性，采用不同的數(shù)學方法預(yù)處理光譜。根據(jù)上述實驗結(jié)果，蛋白質(zhì)建模時采用4 000～9 000 cm-1光譜區(qū)間，建模集與檢驗集樣品比例為4∶1，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用數(shù)學方法預(yù)處理光譜后，模型的主成分數(shù)均有所下降，如采用一階導數(shù)(13)預(yù)處理光譜后，模型主成分有原來的21下降至14。采用不同預(yù)處理方法后建模，蛋白質(zhì)建模集的平均決定系數(shù)為94.44%，檢驗集的平均決定系數(shù)為93.60%，進一步證明采用近紅外光譜技術(shù)建立的蕎麥葉蛋白質(zhì)含量測定模型的穩(wěn)定可靠(表5)。

表5 光譜預(yù)處理方法及平滑點數(shù)對近紅外模型的影響(蛋白質(zhì))Table 5 The influence of different pretreatment and smoothing methods on NIRS prediction results (protein)

根據(jù)上述研究結(jié)果，建模時采用4 000～10 000 cm-1光譜區(qū)間，建模集與檢驗集樣品比例為4∶1，采用不同預(yù)處理方法后建模，所建立模型的主成分數(shù)均下降明顯，如一階導數(shù)(13)處理后，主成分數(shù)由22降至13。預(yù)處理光譜后，GABA建模集的平均決定系數(shù)為88.84%，平均校正標準差和相對誤差分別為0.19和7.75%，檢驗集決定系數(shù)平均為85.26%，平均校正標準差和相對誤差分別為0.22和8.75%。進一步證明采用此光譜范圍近紅外光譜信息所建立的蕎麥葉GABA測定模型穩(wěn)定可靠(表6)。

表6 光譜預(yù)處理方法及平滑點數(shù)對近紅外模型的影響(GABA)Table 6 The influence of different pretreatment and smoothing methods on NIRS prediction results (GABA)

3 結(jié) 論

以粉碎的多年生苦蕎葉片為研究對象，利用化學法測定其蛋白質(zhì)和GABA含量，利用樣品的近紅外光譜結(jié)合定量偏最小二乘法建立了蕎麥葉片蛋白質(zhì)和GABA的預(yù)測模型。從模型建模集和檢驗集的決定系數(shù)來看，苦蕎葉片中蛋白質(zhì)和GABA含量都得到較好的預(yù)測效果。蛋白質(zhì)含量的最佳預(yù)測模型光譜范圍為4 000～9 000 cm-1，一階導數(shù)(13)預(yù)處理光譜，建模集與檢驗集的比例為4∶1，主成分為14時，其建模集和檢驗集的決定系數(shù)分別為93.57%和93.35%。GABA含量的最佳預(yù)測模型光譜范圍為4 000～10 000 cm-1，一階導數(shù)(13)預(yù)處理光譜，建模集與檢驗集的比例為4∶1，主成分為13時，其建模集和檢驗集的決定系數(shù)分別為90.36%和86.32%。

理想的預(yù)測模型需要大量的種質(zhì)資源，盡管本試驗選用大量多年生苦蕎自交系的葉片樣品來建模，但所建模型的預(yù)測效果仍有待優(yōu)化。要想進一步優(yōu)化預(yù)測模型，提高模型的適用范圍和預(yù)測效果，需要進一步增加具有代表性的蕎麥樣品。下一步試驗可加入不同季節(jié)、 不同產(chǎn)地的金蕎麥、 甜蕎麥和苦蕎麥的葉片樣品，進一步完善預(yù)測模型。

本試驗所得的近紅外光譜技術(shù)結(jié)合偏最小二乘法建立的預(yù)測模型可有效的預(yù)測多年生苦蕎葉粉末樣品蛋白質(zhì)和GABA的含量，輔助育種工作，具有一定的實用價值。