湯星陽, 夏 穎, 楊彬彬, 夏黎明

(浙江大學 化學工程與生物工程學院, 浙江 杭州 310027)

1 前 言

土霉素(oxytetracycline，OTC)是在禽、畜養(yǎng)殖業(yè)中最常用的四環(huán)素類抗生素[1]，可通過抑制蛋白質合成對立克次氏體、支原體、衣原體等多種病原菌產(chǎn)生抑制作用[2-3]。許多抗生素在動物腸道內吸收較差，通常會有30%～90%的母體化合物隨動物糞便進入到自然環(huán)境的水體和土壤中[4]。LI 等[5]通過研究發(fā)現(xiàn)渭河流域的四環(huán)素類抗生素殘留量處于中等水平，其中土霉素的殘留量最高(1.56～87.89 ng·L-1)。JIANG 等[6]研究了河北省海河流域中16 種抗生素的含量，發(fā)現(xiàn)水體中土霉素含量高達3.6×105ng·L-1。目前食品中檢出的抗生素含量常常遠超食品藥品監(jiān)督管理局規(guī)定的標準[7]，而長期食用抗生素含量超標的食物會嚴重危害人體健康。

漆酶(Laccase，EC 1.10.3.2)是一類多酚氧化酶[8]，由于其作用底物廣泛，可用于多種有機污染物(包括農(nóng)藥、抗生素等)的降解[9-10]，在環(huán)境治理方面具有重要的應用價值。由于漆酶不能直接氧化具有相對較高氧化還原電勢(＞ 1.3 V)的非酚類底物[11]，通常需要有小分子介體物質參與反應，如人工合成介體2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)、1-羥基苯丙三唑(HBT)、N-羥基-N-乙?；桨?(NHA)等[12]，但人工介體價格較高且有可能對環(huán)境造成二次污染，在實際應用中具有局限性[13]。已發(fā)現(xiàn)木質素降解過程中產(chǎn)生的小分子酚類衍生物如丁香醛、香草醛、香草酮、乙酰丁香酮等可以提高漆酶的催化活性[14]，采用此類天然介體替代人工合成介體，不僅可以大幅度降低成本、而且使用更加安全，在漆酶的規(guī)?；瘧梅矫婢哂兄匾饬x。

本文以土霉素為漆酶的作用底物，研究多種介體對漆酶催化反應的影響，并通過不同介體間的適當組合，構建漆酶-天然介體系統(tǒng)以實現(xiàn)對土霉素的高效降解。

2 材料與方法

2.1 試劑

鹽酸土霉素(CAS 2058-46-0，≥98%)購自上海吉至生化科技有限公司；香草醛(Van)、丁香醛(Syr)、阿魏酸(FA)、對香豆酸(PCA)、香草酮(Vanillone)、1-羥基苯并三唑(HBT)、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)購自生工生物工程(上海)股份有限公司；其他試劑均為分析純以上。

2.2 粗酶液的制備

以水稻秸稈為基質，接入彩絨革蓋菌(Trametes versicolor)固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)10 d[15]，取酶曲后以1:5 的固液比加入pH 4.8 的檸檬酸緩沖液浸泡過夜，過濾離心后取上清液即為粗酶液。

2.3 漆酶對土霉素的降解實驗

在漆酶降解土霉素反應體系中，5 mL 反應體系內含 20 mg·L-1的土霉素，0～0.5 mmol·L-1的介體(丁香醛、香草醛、阿魏酸、對香豆酸、香草酮、ABTS、HBT)，200 mmol·L-1pH 2.5～7.0 的檸檬酸緩沖液以及 0～0.2 IU·mL-1的粗制漆酶液，于 25～70 ℃水浴搖床中 120 r·min-1條件下反應 0～5 h。

2.4 分析測定方法

2.4.1 漆酶活力的測定

采用 ABTS 法，以 2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)為底物，取適當稀釋的酶液 50 μL，加入 950 μL pH 4.0 的檸檬酸緩沖液，30 ℃下加入 2 mmol·L-1ABTS 溶液 1 mL 混勻，于 420 nm 處測定 2 min 內吸光值變化，每分鐘消耗 1 μmol ABTS 所需的酶量定義為一個漆酶活力單位(IU·mL-1)[15]。

2.4.2 高效液相色譜法檢測土霉素

取反應結束的樣品1 mL 過0.45 μm 水膜，利用高效液相色譜儀(Agilent 1200,USA)進行檢測，流動相為 0.01 mol·L-1草酸水溶液:乙腈:甲醇 = 7:2:1，Eclipse XDB-C18(150 mm×4.6 mm×5 μm)色譜柱，流速 0.8 mL·min-1，柱溫30 ℃，檢測波長355 nm，進樣體積20 μL，外標法定量。土霉素降解率計算如下：

式中：C0為反應前土霉素的濃度，C1為降解反應后土霉素的濃度。

3 結果與討論

3.1 不同介體對漆酶降解土霉素的影響

以土霉素為作用底物，介體添加量為0.3 mmol·L-1，研究多種介體(ABTS、HBT、丁香醛、香草醛、阿魏酸、對香豆酸、香草酮)對漆酶降解土霉素的影響，從圖1 可以看出：天然介體丁香醛和香草醛對漆酶降解土霉素具有明顯的促進作用，其效果比常用的人工合成介體ABTS、HBT 更好。丁香醛和香草醛都是木質素降解過程中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物，利用此類天然介體在降解土霉素過程中替代人工合成介體，不僅可大大降低成本，而且對環(huán)境更加友好，具有良好的實際應用價值。

3.2 介體濃度對漆酶降解土霉素的影響

選取ABTS、丁香醛和香草醛 3 種介體，考察介體濃度(0.1～0.5 mmol·L-1)對漆酶降解土霉素的影響，結果如表 1 所示，ABTS 的適宜濃度為 0.4 mmol·L-1，而對于丁香醛和香草醛，在濃度0.1～0.3 mmol·L-1，土霉素降解率隨著介體用量的增加而提高，在0.3 mmol·L-1時達到最大，分別為62.98% 和64.68%，是漆酶-ABTS 系統(tǒng)的1.35 和 1.38 倍。

圖1 不同介體對漆酶降解土霉素的影響Fig.1 Effects of different mediators on oxytetracycline degradation by laccase

表1 介體濃度對土霉素降解率的影響Table 1 Effects of mediator concentrations on oxytetracycline degradation

3.3 漆酶-復合介體系統(tǒng)對土霉素的降解

以介體ABTS、丁香醛、香草醛為基礎，控制反應體系內介體總添加量為0.3 mmol·L-1，通過介體復配考察漆酶對土霉素的降解效果。如圖2(a)所示，在反應體系內添加復合天然介體丁香醛/香草醛(4:6)(記為Syr/Van)時，土霉素降解率可達95.14%，與漆酶-丁香醛和漆酶-香草醛介體系統(tǒng)比較時，漆酶-Syr/Van系統(tǒng)對土霉素的降解效果分別提高了51.06% 和47.09%，表明介體復配可有效提高漆酶對土霉素的降解，其中漆酶-Syr/Van 雙天然介體系統(tǒng)的效果最好。

圖2 漆酶-復合介體系統(tǒng)對土霉素的降解作用Fig.2 Oxytetracycline degradation catalyzed by the laccase-complex mediator system

圖2(b)顯示了漆酶-Syr/Van-ABTS 系統(tǒng)對土霉素的降解效果，在Syr/Van 復合物與ABTS 的比值為7:3 時，土霉素降解率最高可達96.12 %。雖然加入ABTS 后的3 介體系統(tǒng)可以提高漆酶對土霉素的降解率，但ABTS 屬于人工合成介體，在實際推廣應用中成本較高且可能對環(huán)境造成2 次污染。相比之下，采用漆酶-Syr/Van 雙介體系統(tǒng)在實際應用中更為經(jīng)濟可行。

3.4 漆酶-Syr/Van 系統(tǒng)降解土霉素條件優(yōu)化

3.4.1 最適溫度和pH

在反應體系內 Syr/Van 復合物(4:6)添加量0.3 mmol·L-1，漆酶用量0.1 IU·mL-1，25～70 ℃，120 r·min-1，pH 2.5～7.0，反應4 h，考察漆酶-Syr/Van 系統(tǒng)降解土霉素的最適溫度和pH，結果如圖 3 所示。在25～50 ℃，土霉素降解率隨著溫度升高而增加，在50 ℃時降解率達到最高(圖3(a))，由于彩絨革蓋菌所產(chǎn)漆酶具有較好的耐熱性[16]，漆酶-Syr/Van 系統(tǒng)可在寬泛的溫度范圍內實現(xiàn)對土霉素的有效降解。

圖3 溫度和pH 對漆酶-Syr/Van 系統(tǒng)降解土霉素的影響Fig.3 Effects of temperature and pH on oxytetracycline degradation catalyzed by the laccase-Syr/Van system

漆酶-Syr/Van 系統(tǒng)對pH 適應范圍較廣，在pH 3.0～6.0，土霉素降解率及反應結束后的剩余漆酶活力均可保持在60%以上。在pH 4.0～5.0，漆酶對土霉素的降解率可達到90% 以上，其中在pH 4.0 時，土霉素降解率最高(圖3(b))。

3.4.2 漆酶用量

在反應體系內 Syr/Van 復合物(4:6)添加量 0.3 mmol·L-1，漆酶用量 0～0.2 IU·mL-1，50 ℃，120 r·min-1，pH 4.0，反應4 h，考察不同漆酶用量對土霉素降解的影響，結果如圖4 所示：在0～0.1 IU·mL-1漆酶用量，土霉素的降解率隨著漆酶用量的增加而提高；在漆酶用量達到0.1 IU·mL-1之后，繼續(xù)增加漆酶用量不能進一步提高土霉素的降解率。

圖4 漆酶用量對漆酶-Syr/Van 系統(tǒng)降解土霉素的影響Fig.4 Effects of laccase dosage on oxytetracycline degradation catalyzed by the laccase-Syr/Van system

圖5 漆酶-Syr/Van 系統(tǒng)降解土霉素的時間進程Fig.5 Profiles of oxytetracycline degradation processes catalyzed by the laccase-Syr/Van system

3.5 漆酶-Syr/Van 系統(tǒng)降解土霉素的時間進程

在反應體系內 Syr/Van 復合物(4:6)添加量 0.3 mmol·L-1，漆酶用量 0.1 IU·mL-1，50 ℃，120 r·min-1，pH 4.0 條件下，反應0～5 h。定時取樣測定土霉素降解率，結果如圖5 所示：漆酶-Syr/Van 系統(tǒng)對土霉素的降解率1 h 內可達53%，反應4 h 后土霉素的降解率高達95.14%，與漆酶-ABTS 介體系統(tǒng)相比較，優(yōu)勢十分明顯。

土霉素在土壤和水體中的檢出率很高，其具有并四苯結構，在自然環(huán)境中不易分解、殘留期較長[17]。WANG 等[18]利用微生物燃料電池研究土霉素在其中的降解和毒性變化，結果發(fā)現(xiàn)7 天內土霉素降解率可達78%，斑馬魚毒理實驗證明土霉素經(jīng)降解后毒性明顯降低。本文采用漆酶-Syr/Van 系統(tǒng)，成功實現(xiàn)了對土霉素的高效降解，有望在環(huán)境污染治理領域發(fā)揮出重要作用。

4 結 論

利用漆酶介體系統(tǒng)可實現(xiàn)對土霉素的有效降解，發(fā)現(xiàn)木質素降解中間產(chǎn)物丁香醛(Syr)、香草醛(Van)在土霉素降解中可以作為天然介體替代常用的人工合成介體ABTS 和HBT，此類天然介體價格低廉、使用安全。發(fā)現(xiàn)復合介體的效果優(yōu)于單一介體，構建了Syr/Van 雙介體復合物，采用漆酶-Syr/Van 系統(tǒng)4 h內對土霉素的降解率高達95.14 %。本研究結果具有重要的實際應用價值。