蔡 靖, 胡安輝

(1. 浙江工商大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院, 浙江 杭州 310018;2. 浙江環(huán)益資源利用有限公司, 浙江 杭州 311500)

1 前 言

微生物燃料電池(microbial fuel cell，MFC)是以酶或微生物作為催化劑，將化學(xué)能直接轉(zhuǎn)化成電能的裝置[1]。這一概念早在1911 年被提出，但在1991 年才被嘗試應(yīng)用于污水處理[2]。目前文獻報道的MFC大多集中在以有機物作為基質(zhì)[3]。隨著研究的逐漸深入，科學(xué)家們在海底沉積物 MFC 中發(fā)現(xiàn)，MFC 電能的產(chǎn)生與硫化物的氧化緊密相關(guān)[4]，且現(xiàn)有不少文獻報道 MFC 可以廢水中硫化物為基質(zhì)產(chǎn)電[5-8]。然而迄今為止，國內(nèi)外有關(guān)MFC 同時去除硫化物和硝酸鹽的文獻報道極為少見。LEE 等[9]于2013 年使用菌株P(guān)seudomonas sp. C27 構(gòu)建雙室MFC 去除廢水中的硫化物時，研究了陽極中添加硝酸鹽作為電子受體對 MFC 性能的影響。魏炎等[10]則構(gòu)建了以硫化物作為陽極電子供體和硝酸鹽為陰極電子受體的雙室型MFC，實現(xiàn)了硫化物和硝酸鹽的同時去除。研究表明，在缺氧或厭氧狀態(tài)下，某些微生物能夠以硝酸鹽為電子受體將硫化物氧化成單質(zhì)硫[11]。以此為依據(jù)，研發(fā)出同步脫氮除硫工藝，可實現(xiàn)以廢制廢，達到對氮硫2 種污染物同時去除。據(jù)此，研究啟動并運行了無機條件下的同步脫氮除硫燃料電池，并證實該MFC 可同時實現(xiàn)廢水處理和生物發(fā)電，且產(chǎn)電功能與基質(zhì)去除功能間是相互耦聯(lián)的[12-13]。

在MFC 中，陽極室內(nèi)微生物需要在有電環(huán)境中降解污染物質(zhì)，這與普通污水處理(無電環(huán)境)存在明顯不同。因此，MFC 中的產(chǎn)電微生物及微生物群落日益引起關(guān)注[14]。尤其是近年來，分子生物學(xué)手段不斷發(fā)展，其中高通量測序技術(shù)因具有分析結(jié)果準確、高速等特點，被廣泛應(yīng)用于污水處理過程中微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性研究[15]。目前研究大多集中在細菌群落方面，古菌方面研究較少[14]，且迄今未見同步脫氮除硫燃料電池中古菌群落方面的報道。基于此，本研究采用混合菌群，構(gòu)建了4 個相同構(gòu)型的同步脫氮除硫燃料電池，將其在不同外阻條件(100，1 000，10 000 ? 和開路狀態(tài))下運行，考察其產(chǎn)電性能和基質(zhì)去除性能，并采用高通量測序技術(shù)分析陽極室內(nèi)古菌群落特征及群落多樣性，探討外阻條件對同步脫氮除硫燃料電池中古菌群落的影響。

2 材料與方法

2.1 實驗裝置

本研究中所采用的MFC 由有機玻璃制成，采用雙室微生物燃料電池構(gòu)型。其陽極室和陰極室的容積均為350 mL，有效容積為300 mL[13]。陽極室和陰極室中間用質(zhì)子交換膜(Ultrax CMI-7000 Membrane International，USA)分隔。陽極和陰極均為石墨棒(尺寸為Φ1 cm×6 cm，表面積為18.80 cm2)，兩極間由鈦絲和銅導(dǎo)線連接。

陰極液采用高錳酸鉀溶液(濃度為100 mg·L-1，50 mmol·L-1磷酸緩沖液，pH=7.0)，并用磁力攪拌器進行攪拌。陽極液為模擬廢水[16]，并將100 mL 富集污泥接種于陽極室內(nèi)。為了加強進水與污泥的混合，并消除可能的基質(zhì)抑制效應(yīng)，陽極液采用回流泵回流，回流比約為2.5。

本試驗通過間歇進水方式運行同步脫氮除硫燃料電池。采用蠕動泵一次性進水，每天更換基質(zhì)。進水硫化物濃度約為540 mg·L-1。進水前，陽極室內(nèi)通氮氣5 min，以去除溶液中的氧氣。試驗采用4 個相同構(gòu)型的微生物燃料電池，記為R1、R2、R3 和R4。其中R1 外阻為100 ?(遠低于內(nèi)阻值)，R2 外阻為1 000 ?(與內(nèi)阻值一致)，R3 外阻為 10 000 ?(遠高于內(nèi)阻值)，R4 則在開路狀態(tài)(對照組)下運行。

試驗過程中，進水pH 值為(7.0±0.1)。

2.2 分析方法

硝氮(NO3--N)采用紫外分光光度法測定；亞硝氮(NO2--N)采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法測定；氨氮(NH4+-N)采用水楊酸-次氯酸鹽光度法測定；硫化物(S2--S)采用亞甲基蘭分光光度法測定；硫酸鹽(SO42--S)采用鉻酸鋇分光光度法測定[17]。pH 值采用PHS-9V 型酸度計測定。單質(zhì)硫和氮氣產(chǎn)量分別根據(jù)進出水元素質(zhì)量守恒進行計算，則

MFC 輸出電壓(即外阻為 1 000 ? 兩端電壓)數(shù)據(jù)由數(shù)據(jù)采集系統(tǒng) (Agilent 34970A Data Acquisition/Switch Unit) 收集，每隔10 min 自動測定一次。電流密度則根據(jù)電流和電極凈表面積進行歸一化計算。

2.3 高通量測序及分析

3 結(jié)果與討論

圖1 同步脫氮除硫微生物燃料電池的基質(zhì)去除情況Fig.1 Performance of substrate removal in MFCs with simultaneous desulfurization and denitrification

3.1 基質(zhì)去除情況

當(dāng)進水硫化物濃度維持在540 mg·L-1時，不同外阻時同步脫氮除硫燃料電池的基質(zhì)去除情況如圖1 所示。當(dāng)外阻為100 ? 時，R1 出水中未檢測出硝酸鹽，亞硝酸鹽濃度僅為0.02 mg·L-1，硝酸鹽去除率為100%，且氮氣產(chǎn)率高達99.97%；隨著外阻的增加，MFC 中硝酸鹽去除率仍高于 96.50%，氮氣產(chǎn)率高于 96.30%，這表明，不論外阻如何改變，同步脫氮除硫燃料電池中硝酸鹽還原的主要產(chǎn)物為氮氣。

與高硝酸鹽去除情況類似，同步脫氮除硫燃料電池中硫化物去除率也很高，均高于99.60%。但硫化物氧化產(chǎn)物分布情況卻有明顯不同。當(dāng)外阻為100 ? 時，R1 硫酸鹽產(chǎn)率最高，為88.35%；隨著外阻分別提高至 1 000 和 10 000 ? 時，R2 和 R3 中硫酸鹽產(chǎn)率分別下降至71.14 %～71.75%。當(dāng)開路狀態(tài)時，R4 硫酸鹽產(chǎn)率則降至28.3%。在同步脫氮除硫燃料電池中，硝酸鹽為電子受體，硫化物為電子供體，即硫化物氧化提供電子用于硝酸鹽還原。據(jù)文獻報道，硫化物氧化提供的電子數(shù)量大于硝酸鹽還原所接受的電子數(shù)量，且該電子數(shù)量差額與該微生物燃料電池產(chǎn)電性能呈正相關(guān)。因此推測硫化物氧化多余的電子用于產(chǎn)電[12]。而在開路狀態(tài)時，MFC 內(nèi)沒有電子流動，因此硫化物無需提供多余電子用于產(chǎn)電，故硫酸鹽產(chǎn)率較低。

同步脫氮除硫燃料電池的進水 S/N 比在 2.15～2.58，根據(jù)化學(xué)反應(yīng)式， 理論產(chǎn)物為氮氣和單質(zhì)硫，但實際產(chǎn)物為氮氣、硫酸鹽和單質(zhì)硫。這表明，外阻影響了同步脫氮除硫燃料電池的產(chǎn)物類型和濃度。

3.2 產(chǎn)電情況

在不同外阻情況下，同步脫氮除硫燃料電池的產(chǎn)電趨勢與以往文獻報道類似[20]。在本研究中，為了更好地統(tǒng)計分析產(chǎn)電情況，采用箱形圖來表示不同外阻時同步脫氮除硫燃料電池中的輸出電壓及電流密度(圖2)。箱形圖中箱體代表第25% 和75% 之間的數(shù)據(jù)，或被稱為上下四分位，這意味著其包含了50%的數(shù)據(jù)。

圖2 同步脫氮除硫微生物燃料電池的電能產(chǎn)生情況Fig.2 Performance of electricity generation in MFCs with simultaneous desulfurization and denitrification

如圖2(a)所示，當(dāng)外阻為100 ? 時，R1 產(chǎn)生電壓的上下四分位范圍為0.003～0.017 V，中值為0.004 V；當(dāng)外阻為1 000 ? 時，R2 產(chǎn)生電壓的上下四分位范圍為0.051～0.133 V，中值為0.064 V；當(dāng)外阻為10 000? 時，R3 產(chǎn)生電壓的上下四分位范圍為0.630～0.820 V，中值為0.650 V。當(dāng)脫氮除硫燃料電池處于開路狀態(tài)時，R4 電極兩側(cè)電壓的上下四分位范圍為0.864～1.035 V，中值為0.979 V。這表明，隨著外阻的增大，MFC 產(chǎn)生的電壓值也逐漸增大，即陽極電勢逐漸提高。

MFC 輸出電壓值與外阻值密切相關(guān)，因此，為了均一化外接電阻影響，更好地表示同步脫氮除硫燃料電池的產(chǎn)電情況，本文又采用電流密度來表示其產(chǎn)電能力(圖2(b))。當(dāng)同步脫氮除硫燃料電池處于開路狀態(tài)時，R4 的電流密度則為0。當(dāng)外阻為100 ? 時，R1 上下四分位電流密度范圍為15.50～89.19 mA·m-2，中值為 20.63 mA·m-2；當(dāng)外阻為 1 000 ? 時，R2 上下四分位電流密度范圍為 27.09～70.52 mA·m-2，中值為34.18 mA·m-2；當(dāng)外阻為 10 000 ? 時，R1 上下四分位電流密度范圍為 33.45～43.52 mA·m-2，中值為 34.52 mA·m-2。這表明，電流密度也隨著外阻增大而增大，但其增大趨勢并沒有如電壓那樣明顯。

3.3 群落情況

本試驗中R1、R2、R3 和R4 樣品測序所得的總序列數(shù)分別為44 221，57 258，54 877 和54 985，將所有序列按照97%相似性進行劃分OTU，得到OTU 數(shù)量分別為255，210，379 和304，且 Coverage 值均高于99.9%，這表明樣品文庫覆蓋率高，數(shù)據(jù)可靠。

如圖3 所示，在4 個樣品中，含量最高的是廣古菌門(Euryarchaeota)，其相對豐度分別為 53.36 %(R1)、63.49%(R2)、65.36%(R)和 62.31%(R4)；排名第 2 的是未分類古菌門(Archaea_unclassified)，其相對豐度分別為42.59 %(R1)、32.39%(R2)、32.73%(R3)和 32.99%(R4)。深古菌門(Bathyarchaeota)和奇古菌門(Thaumarchaeota)的排名不一致，在R1 和R4 中，Bathyarchaeota 的相對豐度略小于 Thaumarchaeota；而在 R2 和 R3 中，Bathyarchaeota 的相對豐度略大于Thaumarchaeota。不過，Bathyarchaeota 和Thaumarchaeota 相對豐度較小，均低于2.00%。

如圖4，根據(jù)屬分類水平上相對豐度，將污泥中古菌分為優(yōu)勢菌屬(相對豐度≥10%) 、常見菌屬(10%≥相對豐度≥1%)和稀有菌屬(相對豐度≤1%)[21]。在屬分類水平上，R1 中未分類古菌屬(Archaea_unclassified，相對豐度為 42.59%)，甲烷桿菌屬(Methanobacterium，相對豐度為 31.16%) 為優(yōu)勢菌屬；R2 中Archaea_unclassified (相對豐度為 32.39%)，Methanobacterium (相對豐度為 30.32%) 和甲烷鬃菌屬(Methanosaeta，相對豐度為 14.25%) 是優(yōu)勢菌屬；R3 中 Archaea_unclassified (相對豐度為 32.73%)，Methanobacterium (相對豐度為 18.17%)，甲烷繩菌屬(Methanoregula，相對豐度為18.07%)和Methanosaeta (相對豐度為17.20%)是優(yōu)勢菌屬；R4 中Archaea_unclassified (相對豐度為32.99%)，Methanobacterium (相對豐度為29.22%)和Methanoregula (相對豐度為15.79%) 是優(yōu)勢菌屬。

圖3 門分類水平上的同步脫氮除硫微生物燃料電池古菌群落結(jié)構(gòu)Fig.3 Archaeal community of MFCs with simultaneous desulfurization and denitrification at Phylum level

除了 Archaea_unclassified 以外，優(yōu)勢菌屬均屬于Euryarchaeota 門，且都是與產(chǎn)甲烷有關(guān)，這是一個很有意思的現(xiàn)象。羅劍飛[22]在研究含高濃度硫化物的印染廢水處理系統(tǒng)的古菌群落結(jié)構(gòu)時，構(gòu)建了古菌16SrRNA 基因克隆文庫，并發(fā)現(xiàn)古菌文庫主要由甲烷微菌屬(Methanomicrobia，占99%) 組成，而沒有發(fā)現(xiàn)典型自養(yǎng)型硫氧化古菌Sulfolobales 的存在[23]。但在本研究中，進水基質(zhì)中并沒有添加有機物，為化能自養(yǎng)型環(huán)境。據(jù)文獻報道，在生物電化學(xué)體系中，二氧化碳可以直接利用電子轉(zhuǎn)化為甲烷，這意味著產(chǎn)甲烷菌可能是潛在的嗜電微生物[24]，或被稱為電營養(yǎng)型(Electrotrophic)微生物，如Methanococcus maripaludis 和Methanobacterium palustre F[25]。推測在同步脫氮除硫燃料電池陽極室中，產(chǎn)甲烷菌利用硫化物氧化提供的電子進行生長，具體機理還有待進一步研究。

3.4 多樣性分析

表1 介紹了不同外阻時同步脫氮除硫微生物燃料電池中種群豐富度指數(shù)和群落多樣性指數(shù)。ACE 指數(shù)和Chao 指數(shù)屬于α 生物多樣性指數(shù)，反映每個樣品內(nèi)部群落的豐富度，數(shù)值越大，說明樣品中物種越豐富[26]。ACE 指數(shù)反應(yīng)的趨勢與 Chao 指數(shù)類似，其大小順序為 R3＞R4＞R1＞R2。這表明，當(dāng)外阻為10 000 ? 時，陽極室內(nèi)古菌群落豐富度最高，后依次是開路情況、外阻為100 ? 和外阻為1 000 ?。

Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)也屬于α 生物多樣性指數(shù)，但反映的是每個樣品的多樣性程度。若以Shannon 指數(shù)作為評判依據(jù)， 其變化趨勢是R1＞R4＞R3＞R2；而以 Simpson 指數(shù)作為評價依據(jù)，其變化趨勢是 R2＞R3＞R4＞R1。若單純從 Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)數(shù)值來看，兩者變化趨勢剛好相反。Shannon 指數(shù)越大，表明樣品群落多樣性越高[27]。然而，Simpson 指數(shù)體現(xiàn)的是優(yōu)勢物種生物量占群落生物總量的比重，該指數(shù)越大，表明優(yōu)勢菌群生物量占總生物量比重越小，反之則優(yōu)勢菌群生物量占總生物量比重越大[28]，換言之，Simpson 指數(shù)值越小，說明群落多樣性越高。因此，當(dāng)外阻為1 000 ? 時，陽極室內(nèi)古菌群落多樣性最高，其后是外阻為10 000 ?，開路情況和外阻為100 ?。

圖4 屬分類水平上的同步脫氮除硫微生物燃料電池古菌群落結(jié)構(gòu)Fig.4 Archaeal community of MFCs with simultaneous desulfurization and denitrification at Genus level

表1 不同外阻時種群豐富度指數(shù)和群落多樣性指數(shù)Table 1 Richness and diversity indices under various external resistances

圖5 不同外阻時MFC 中古菌群落PCA 圖Fig.5 PCA analysis of archaeal community in MFCs with various external resistances

β 多樣性指數(shù)是用來描述不同因素下群落結(jié)構(gòu)間的差異性，是分析生物多樣性的重要組成部分，PCA 就是其中重要一種分析方法。圖5 為不同外阻時對同步脫氮除硫微生物燃料電池中古菌群落進行主成份分析。第 1主軸解釋度為52.23%，第2 主軸解釋度為38.11%，共解釋了外阻變化的90.34%。在圖5 中，R1 和R4 比較接近，在第2 象限，而R2 和R3 則分別在第3 和第1 象限中。這表明，從群落多樣性角度來看，不同外阻的確對脫氮除硫燃料電池中的古菌群落發(fā)生了影響。這與以往文獻報道的結(jié)果一致。吳義誠等[29]采用高通量測序技術(shù)研究了在開路和閉路條件下沉積物微生物燃料電池中陽極生物膜細菌結(jié)構(gòu)差異，發(fā)現(xiàn)開路條件下菌群多樣性更豐富，這表明MFC 運行過程中的電子傳遞影響了微生物群落結(jié)構(gòu)。 KIM 等[30]采用單室MFC 處理低pH 酒精廢水，并研究了其在不同外阻情況(100、500、1 000 和 5 000 ?) 時的微生物群落。其測序結(jié)果表明，隨著外阻改變，微生物群落在門水平上存在明顯差異。

3.5 討論

外阻是影響 MFC 中微生物群落的重要因素之一[31]。在同步脫氮除硫燃料電池中，外阻對陽極室內(nèi)古菌群落的影響可分為直接和間接兩方面。直接影響指的是MFC 產(chǎn)生電能，直接作用于陽極室內(nèi)古菌群落，從而對其群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。外阻控制了從陽極流向陰極的電子數(shù)量(電流密度)，這將對微生物群落產(chǎn)生顯著影響。除此以外，外阻還影響輸出電壓，從而間接影響MFC 陽極電勢。陽極電勢是MFC 運行的重要參數(shù)，決定了微生物群落獲得的能量。另一方面，間接影響指的是陽極室內(nèi)的環(huán)境條件。外阻變化影響了陽極液中的產(chǎn)物類型和濃度，這將改變微生物的生存環(huán)境，從而間接影響了微生物群落結(jié)構(gòu)。

為了分析外阻引起的電能變化對群落結(jié)構(gòu)的影響，分別對電壓及電流密度與群落豐富度及群落多樣性指數(shù)進行Pearson 相關(guān)性分析(表2)。結(jié)果表明，ACE，Chao，Shannon 和Simpson 指數(shù)與電壓之間呈正相關(guān)；而ACE，Chao，Shannon 指數(shù)與電流密度呈負相關(guān)，而Simpson 指數(shù)卻與電流密度呈正相關(guān)。換言之，增加電壓，有助于提高群落豐富度和多樣性；然而提高電流密度，卻使群落豐富度和多樣性下降。但在所試范圍內(nèi)，電壓(或電流密度)對所有指數(shù)均無顯著性影響(p＞0.05)。

表2 Pearson 相關(guān)性分析Table 2 Pearson correlation analysis

在脫氮除硫燃料電池中，硝酸鹽被還原為氮氣，硫化物則氧化為硫酸鹽和單質(zhì)硫。在上述產(chǎn)物中，僅硫酸鹽為離子態(tài)，其余為氣體或固體，故選擇陽極液中硫酸鹽濃度作為外部環(huán)境因素。因此，為了分析外阻誘發(fā)的外部環(huán)境變化對群落結(jié)構(gòu)的影響，將硫酸鹽濃度與群落豐富度及群落多樣性指數(shù)進行Pearson 相關(guān)性分析(表2)。結(jié)果顯示，Shannon 指數(shù)與硫酸鹽濃度呈正相關(guān)，ACE，Chao 和Simpson 指數(shù)呈負相關(guān)。這表明，隨著硫酸鹽濃度增加，群落豐富度下降，但多樣性上升。但在所試范圍內(nèi)，硫酸鹽濃度對所有指數(shù)均無顯著性影響(p＞0.05)。

綜上所述，盡管改變外阻會對陽極室內(nèi)微生物群落有所影響(圖3～5)，但并未對古菌群落的豐富度和多樣性產(chǎn)生顯著性影響(p＞0.05)。以接種污泥作為對照，筆者曾采用聚合酶鏈反應(yīng)-變性梯度凝膠電泳(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE)方法研究了4 種不同運行模式下的同步脫氮除硫燃料電池陽極室內(nèi)細菌群落結(jié)構(gòu)[32]。試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，盡管 MFC 產(chǎn)電性能存在明顯差異，但群落多樣性指數(shù)(Shannon 指數(shù), Simpson 指數(shù)和Equitability 指數(shù))與電能產(chǎn)生并無顯著性聯(lián)系。LYON 等[33]發(fā)現(xiàn)改變外阻確實會對 MFC 中微生物群落結(jié)構(gòu)有所影響，但在不同外阻情況下建立的不同微生物群落結(jié)構(gòu)，卻產(chǎn)生了相似的發(fā)電量，這證明了MFC 系統(tǒng)的靈活性。

4 結(jié) 論

(1) 在所試外阻范圍內(nèi)(100、1 000、10 000 ? 和開路狀態(tài))，同步脫氮除硫燃料電池均表現(xiàn)出高基質(zhì)去除性能；硫化物氧化產(chǎn)物主要為硫酸鹽和單質(zhì)硫，其產(chǎn)物類型隨著外阻變化而有所改變。硝酸鹽還原產(chǎn)物主要為氮氣。同步脫氮除硫燃料電池中輸出電壓和電流密度均隨著外阻增大而增大，但電流密度增長幅度較緩。

(2) 通過高通量測序，分別從門分類水平和屬分類水平對陽極室內(nèi)污泥古菌群落進行分類分析。在四個污泥樣品中，Euryarchaeota 門相對豐度皆為最高。結(jié)果表明，改變外阻會對陽極室內(nèi)微生物群落結(jié)構(gòu)有所影響，但并未對同步脫氮除硫燃料電池中古菌群落豐富度和多樣性產(chǎn)生顯著性影響(p＞0.05)。