段振華，黃 宇，胡明英，劉香林，李 苗，梁俊武，甘甲忠，何 穎，甘一波，黎 軍

（1.玉林市動物疫病預(yù)防控制中心，廣西玉林 537000；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，江蘇南京 210095；3.廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所，廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530001；4.玉林市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，廣西玉林 537000）

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的重要豬傳染病之一，主要表現(xiàn)為不同年齡段豬只的呼吸道綜合征、發(fā)熱、出血，以及母豬流產(chǎn)和產(chǎn)弱仔、死胎或木乃伊胎為特征的繁殖障礙[1]。我國大陸地區(qū)1996 年首次報(bào)道此病并分離到病毒。2006 年暴發(fā)的高致病性PRRS 疫情給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失[2-3]。由于PRRSV 會破壞動物機(jī)體的免疫系統(tǒng)，從而造成免疫抑制，破壞或影響其他疫苗的免疫應(yīng)答，繼而增加其他疾病的感染風(fēng)險(xiǎn)。所以，臨床上PRRSV 常與其他病毒和細(xì)菌發(fā)生混合感染[4-5]。黎軍等[6]報(bào)道2015—2019 年廣西14 個(gè)地市不同規(guī)模類型豬場PRRSV、豬瘟病毒（CSFV）、圓環(huán)病毒2 型（PCV2）、豬偽狂犬病病毒（PRV）和豬流行性腹瀉病毒（PEDV）的多重混合感染現(xiàn)象較為普遍。李明波等[7]對PRRSV 和細(xì)菌混合感染的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，豬群感染PRRSV 后，易繼發(fā)鏈球菌、副豬嗜血桿菌、多殺性巴氏桿菌等的混合感染。廣西是我國生豬主產(chǎn)區(qū)之一，其中玉林市的生豬總產(chǎn)量位列廣西首位。近年來，隨著玉林市養(yǎng)豬場的規(guī)模化、集約化發(fā)展，豬群飼養(yǎng)密度日益增大，造成部分地區(qū)出現(xiàn)PRRS等多種豬病流行，對養(yǎng)豬業(yè)的危害日趨嚴(yán)重。因此，為了解廣西玉林市豬群中的PRRSV 流行情況和與其他病原的混合感染情況，對2016—2018 年采集的臨床健康豬群血清樣本以及表現(xiàn)呼吸道癥狀和繁殖障礙的發(fā)病豬組織樣本進(jìn)行PRRSV 病原檢測，并對PRRSV 陽性樣本進(jìn)行CSFV、PCV2 和PRV 的混合感染檢測，旨在為此類疫病的有效防控提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

DL 2 000 DNA Marker、PremixTaqTM（ExTaqTMVersion 2.0 plus dye）、PrimeScriptTMOne step RT-PCR Kit Ver.2，均為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品；TGuide S32 磁珠法病毒DNA/RNA 提取試劑盒，購自天根生化科技有限公司。

1.2 血清樣本

2016—2018 年，從玉林市7 個(gè)縣（市、區(qū)）選擇母豬存欄300 頭以上規(guī)模化豬場的臨床健康豬群為目標(biāo)群，根據(jù)各縣（市、區(qū)）目標(biāo)群數(shù)量，按比例確定研究豬場數(shù)量后，采集各豬場母豬、保育豬或育肥豬血清樣品共計(jì)661 份，其中2016 年32個(gè)場、306 份血樣，2017 年15 個(gè)場、119 份血樣，2018 年20 個(gè)場、236 份血樣（表1）。

1.3 組織病料

2016—2018 年，共收集玉林市7 個(gè)縣（市、區(qū)）規(guī)模豬場送檢的896 份發(fā)病豬（包含死豬）病料，包括流產(chǎn)胎兒或死胎，以及有呼吸困難、發(fā)燒、皮膚發(fā)紅、腹瀉等臨床癥狀的哺乳仔豬、保育豬、育肥豬和母豬的組織病料，其中2016 年57 個(gè)場次、235 份，2017 年82 個(gè)場次、284 份，2018 年124個(gè)場次、377 份（表2）。

表1 2016—2018 年廣西玉林市各縣（市、區(qū)）血清樣本統(tǒng)計(jì)

表2 2016—2018 年廣西玉林市組織病料樣本統(tǒng)計(jì)

1.4 病毒DNA/RNA 提取

1.4.1 血清樣本 抽取200 μL 血清，按照TGuide S32 磁珠法病毒DNA/RNA 抽提試劑盒說明書提取DNA/RNA，將所獲得的DNA/RNA 直接進(jìn)行PCR/RT-PCR 檢測或置于-70 ℃保存。

1.4.2 組織病料 按1:5 質(zhì)量比，加入生理鹽水，在組織研磨儀內(nèi)研磨，反復(fù)凍融3 次，4 ℃條件下，10 000 r/min 離心5 min，取上清抽提DNA/RNA或保存于-70 ℃冰箱備用。按照TGuide S32 磁珠法病毒DNA/RNA 抽提試劑盒說明書提取DNA/RNA，然后將所獲得的DNA/RNA 直接進(jìn)行PCR/RT-PCR 或置于-70℃保存。

1.5 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank 中公開發(fā)表的PRRSV、CSFV、PCV2 和PRV 基因序列，利用Meg Align（DNAstar）和Primer Premier 7.0 軟件設(shè)計(jì)引物，送至生工生物工程（上海）服務(wù)有限公司合成。引物信息詳見表3。

1.6 PRRSV 檢測

利用特異性引物，對提取的樣品RNA 進(jìn)行一步法RT-PCR 擴(kuò)增。RT-PCR 擴(kuò)增體系25 μL：Prime Script 1 step Enzyme Mix 1 μL，2×1 Step Buffer（Dye Plus）12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，RNA 模板5 μL，ddH2O 5.5 μL。RT-PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件：50 ℃ 30 min，94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，57 ℃，退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取10 μL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表3 引物信息

1.7 其他病原檢測

將檢出的PRRSV 陽性樣本進(jìn)行CSFV、PCV2和PRV 病原檢測，并統(tǒng)計(jì)PRRSV 陽性樣本中，上述3 種病原的混合感染情況。其中：CSFV 的RTPCR 檢測方法同1.6；PCV2、PRV 的PCR 檢測，采用特異性引物，對提取的樣品DNA 進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增體系25 μL：PremixTaq12.5 μL，DNA 模板5 μL，上下游引物各0.5 μL，ddH2O 7 μL；PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，按表2 退火溫度，退火40 s，72 ℃延伸70 s，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取10 μL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 血清樣本的PRRSV 檢測

結(jié)果（表4）顯示：2016—2018 年廣西玉林市規(guī)模豬場PRRSV 血清樣本陽性率分別為6.86%、19.33%和10.17%，豬場陽性率分別為25.00%、46.67%和40.00%，整體呈上升趨勢；3 年內(nèi)玉林市7 個(gè)縣（市、區(qū)）均有PRRSV 陽性樣本被檢出，說明PRRSV 流行廣泛。

2.2 血清樣本的混合感染檢測

對68 份PRRSV 陽性血清樣品進(jìn)行了CSFV、PCV2 和PRV 病原檢測。結(jié)果（表5）顯示，2016—2018 年P(guān)RRSV 陽性血清樣本的混合感染率分別為52.38%（11/21）、65.22%（14/23）、62.50%（15/24），其中與PCV2 的混合感染率最高，其次是與PRV。

2.3 病料樣本的PRRSV 檢測

對采集的流產(chǎn)胎、死胎以及不同豬群發(fā)病組織樣本進(jìn)行了PRRSV 病原檢測。結(jié)果（表6）顯示，2016—2018 年病料組織樣本的PRRSV 檢出率分別為46.38%、48.24%、48.81%，場陽性檢出率分別為42.11%、35.37%、37.10%，平均樣本陽性檢出率和場陽性檢出率分別為48.00%和37.64%。母豬、保育豬以及流產(chǎn)胎、死胎樣本的PRRSV 檢出率較高，分別為58.82%、52.66%和50.23%；母豬和育肥豬的場PRRSV 檢出率較高，分別為43.48%和46.67%（表7）。

表4 2016—2018 年廣西玉林市規(guī)模豬場血清中PRRSV 檢測結(jié)果統(tǒng)計(jì)

表5 2016—2018 年廣西玉林市規(guī)模豬場PRRSV 陽性血清中其他病原混合感染統(tǒng)計(jì)

2.4 病料樣本的混合感染檢測

對病料樣本中檢出的430 份PRRSV 陽性樣本進(jìn)行了CSFV、PCV2 和PRV 病原檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2016—2018 年P(guān)RRSV 陽性樣本的混合感染率分別為50.00%、52.99%、52.35%，其中與PCV2的混合感染率最高，分別為45.28%、49.25%、49.41%，其次是與PRV 的混合感染，分別為14.15%、14.93%、14.12%（表8）。

對不同PRRSV 陽性病料的混合感染情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，流產(chǎn)胎/死胎和哺乳仔豬的混合感染率較低，PRRSV 單一感染率較高，而隨著日齡增長，保育豬和育肥豬的混合感染率依次升高，分別為58.17%和64.71%。

表6 2016—2018 年廣西玉林市規(guī)模豬場病料樣本的PRRSV 病原檢測結(jié)果

表7 2016—2018 年廣西玉林市規(guī)模豬場病料樣本的PRRSV 陽性場統(tǒng)計(jì)結(jié)果

表8 發(fā)病組織樣本中PRRSV 與其他病原的混合感染檢測結(jié)果

3 討論

本研究對廣西玉林市規(guī)?；i場健康豬群的血清樣本和病料組織樣本進(jìn)行了PRRSV 病原檢測，發(fā)現(xiàn)血清樣本平均陽性率為10.29%，且呈上升趨勢，而病料組織樣本陽性檢出率一直維持在48.00%的較高水平。畢峻龍[8]對2013—2018 年云南不同地區(qū)規(guī)模豬場收集的2 234 份樣品進(jìn)行PRRSV 病原檢測，發(fā)現(xiàn)2016—2018 年的檢出率分別為21.08%、33.06%和41.72%，也呈上升趨勢，與本研究結(jié)果一致，說明PRRS 流行依然較嚴(yán)重，仍是當(dāng)前對我國生豬養(yǎng)殖業(yè)危害最嚴(yán)重的豬病之一[9-10]。規(guī)模豬場PRRSV 感染有加重趨勢，有可能與2017 年P(guān)RRS 退出國家強(qiáng)制免疫政策后，豬場防控意識減弱有關(guān)。為節(jié)約成本，部分豬場減少了PRRSV 疫苗的免疫次數(shù)和用量，但又缺乏完備的保障措施[11]。

本研究發(fā)現(xiàn)，玉林市規(guī)模豬場PRRSV 與其他病原的混合感染較為嚴(yán)重，最為常見的是PRRSV與PCV2 的混合感染，其次是與PRV。這與劉曉東[12]、Ouyang[13]和Chen等[14]研究發(fā)現(xiàn)的我國部分地區(qū)規(guī)模豬場中PRRSV 與PCV2 混合感染比例最高，其次是PRV 的研究結(jié)果相似。PRRSV 通過呼吸道或生殖道侵入豬體內(nèi)，在豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAM）內(nèi)大量增殖，從而使其失去抗原遞呈和吞噬清除功能，并且以PAM 為載體轉(zhuǎn)移到全身，使機(jī)體非特異免疫功能急劇下降，因此增加了豬體繼發(fā)其他病毒或細(xì)菌感染的概率，導(dǎo)致疾病的臨床癥狀變得更為復(fù)雜[15]。PCV2 也是一種主要通過侵害機(jī)體單核細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞，造成機(jī)體免疫抑制的病原。有研究[16-17]表明，PCV2 與PRRSV 的感染有協(xié)同作用，當(dāng)豬體感染PRRSV時(shí)引發(fā)了PAM 的凋亡和崩解，摧毀了肺部的初級防疫，此時(shí)PCV2 可以借助低水平的感染，逃避宿主免疫反應(yīng)機(jī)制而不被識別，然后進(jìn)一步感染PAM細(xì)胞并大量繁殖，并且聯(lián)合導(dǎo)致病豬臨床癥狀加劇，其嚴(yán)重程度與其體內(nèi)兩種病毒載量的水平呈正相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，流產(chǎn)胎/死胎、哺乳仔豬中PRRSV 與其他病原的混合感染率較低，而保育豬和育肥豬群的混合感染率依次增高。這與李記蕾等[18]對從河南省送檢的豬血清進(jìn)行檢測，得到妊娠母豬陽性率為70%、哺乳仔豬陽性率為55.00%、保育豬陽性率為47.00%、育肥豬陽性率為74.00%的結(jié)果相似。這說明PRRSV 對各生長階段豬群均有危害，既可以通過呼吸道在豬群中水平傳播，也能通過母豬胎盤屏障進(jìn)行垂直傳播，是造成豬場發(fā)病率和病死率上升的主要因素之一[19]。同時(shí)，隨著日齡的增加，保育階段豬只的母源抗體下降到達(dá)臨界值，而自身抗體還未產(chǎn)生，同時(shí)感染其他病原的機(jī)會也在增多，所以保育豬和育肥豬群的多種病原混合感染率逐漸增高。

由于規(guī)模豬場采集組織樣品的可操作性受限制，本次研究中血清樣本的采樣場點(diǎn)和樣本量有限，研究結(jié)果可能和玉林市規(guī)模豬場中PRRSV、PCV和PRV 的實(shí)際感染率有一定的誤差，但臨床表現(xiàn)健康的豬血清樣本中所檢測到的上述病原的陽性率結(jié)果，仍能說明近年來玉林市部分規(guī)?；i場存在PRRSV、PCV2 和PRV 的隱性混合感染情況，應(yīng)據(jù)此制定相應(yīng)的免疫程序，采取相關(guān)措施加強(qiáng)防控。

表9 不同病料樣本的PRRSV 單一感染和混合感染統(tǒng)計(jì)結(jié)果

4 結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)：廣西玉林市規(guī)模化豬場中PRRSV流行廣泛，且有加重趨勢；同時(shí)存在一定的隱性帶毒風(fēng)險(xiǎn)，且與PCV2 和PRV等病原的混合感染較嚴(yán)重。因此，玉林市規(guī)模豬場應(yīng)制定科學(xué)的免疫程序，采取綜合措施，加強(qiáng)這些疫病的防控。