張 慧，張安潔，張 鋒，尼 博，劉 爽，崔 進(jìn)，董雅琴，李曉成，魏 榮

（1.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，云南昆明 650201）

豬血凝性腦脊髓炎病毒（porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus，PHEV）屬于冠狀病毒科β 冠狀病毒屬，1962 年在加拿大首次被分離到[1]。豬是PHEV 唯一自然易感動(dòng)物，所有年齡的豬對(duì)其均易感，3～4 周齡以下仔豬感染后較易出現(xiàn)臨床癥狀，表現(xiàn)為厭食、嘔吐、沉郁、肌肉顫抖等，最后消瘦、死亡，致死率可高達(dá)100%[2-3]。血清學(xué)調(diào)查[3-4]顯示，該病的隱性感染在我國(guó)及世界各地普遍存在。鑒于目前尚無疫苗可用及基因變異的潛在威脅，該病的病原學(xué)診斷非常重要。本研究建立了PHEV 快速、特異、敏感的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 檢測(cè)方法，并進(jìn)行了臨床樣品檢測(cè)的初步應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

超凈工作臺(tái)：美國(guó)Forma Scientific 公司；移液器：Eppendorf；渦旋振蕩器：美國(guó)Scientific Industries 公司；熒光定量PCR 儀：Bio-Rad CFX96 Real-time PCR System；核酸提取儀：德國(guó)QIAGEN 公司；電泳儀：Bio-Rad 公司；凝膠成像系統(tǒng)：Bio-Rad GelDoc EZ。

HiScript II U+One Step qRT-PCR Probe Kit，2×TaqMaster Mix（Dye Plus）：諾唯贊生物科技有限公司；Evo M-MLV 一步法RT-PCR 試劑盒：艾科瑞生物工程有限公司；核酸提取試劑盒：德國(guó)QIAGEN 公 司；Low-Profile PCR Tubes 8-tube strip、Optically clear flat 8 Cap Strips：Bio-Rad 公司。異丙醇、無水乙醇等，均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 引物、探針設(shè)計(jì)及陽性質(zhì)粒合成

GenBank 中下載不同國(guó)家、不同分離時(shí)間的PHEV 毒株結(jié)構(gòu)蛋白（S、M、N、HE）基因序列，采用MEGA 6.0 進(jìn)行序列比對(duì)，選擇加拿大分離株（GenBank 登錄號(hào)AF481863）N 蛋白基因?yàn)閰⒖夹蛄校胮rimer express 3.0.1 軟件設(shè)計(jì)引物和探針。將該N 蛋白基因序列送至華大基因公司合成并克隆至Puc57 質(zhì)粒，構(gòu)建重組質(zhì)粒Puc57-PHEVn。

1.3 反應(yīng)條件優(yōu)化

依次選擇PHEV-f、PHEV-r 終濃度0.9、0.3、0.1 μmol/L，probe 終濃度0.05、0.15、0.25 μmol/L，退火溫度56、57、58 ℃進(jìn)行正交試驗(yàn)，優(yōu)化反應(yīng)條件。配制反應(yīng)體系20 μL：2×One Step U+Mix 10 μL、One Step U+Enzyme Mix 1 μL，引物和探針按終濃度加入，陽性質(zhì)粒Puc57-PHEVn（34 ng/μL）1 μL，RNase free ddH2O 補(bǔ)齊至20 μL。RT-PCR 反應(yīng)條件為：第1 階段，55 ℃15 min；第2 階段，95 ℃ 30 s；第3 階段，95 ℃10 s，56～58 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)。

1.4 敏感性和特異性評(píng)估

先將Puc57-PHEVn 稀釋至1 ng/μL，之后依次10 倍稀釋至10-1～10-7ng/μL；取1 μL 作為反應(yīng)模板，按照1.3 中優(yōu)化好的反應(yīng)條件進(jìn)行實(shí)時(shí)RT-PCR 反應(yīng)，評(píng)估敏感性；每個(gè)梯度重復(fù)2 次，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。提取豬繁殖與綜合征病毒（PRRSV）、豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬圓環(huán)病毒2 型（PCV2）核酸，評(píng)估該方法的特異性。

1.5 臨床樣品檢測(cè)

采集山東、廣西、河南、江西等地發(fā)病豬組織樣品共計(jì)233 份，加入PBS（pH7.2）緩沖液勻漿，4 ℃ 12 000 r/min 離心10 min；取上清提取病毒核酸，加入上述反應(yīng)體系進(jìn)行實(shí)時(shí)RT-PCR。同時(shí)，參照Sekiguchi等[2]2004 年建立的巢式PCR 方法，對(duì)樣品核酸進(jìn)行平行檢測(cè)，并將擴(kuò)增目的片段送華大基因測(cè)序，同時(shí)與本試驗(yàn)建立方法進(jìn)行結(jié)果比對(duì)，計(jì)算兩種方法的符合率。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物和探針篩選

最終篩選出的上下游引物和探針序列見表1。探針5'端進(jìn)行熒光基團(tuán)Texas red 標(biāo)記，3'端進(jìn)行淬滅基團(tuán)BHQ2 標(biāo)記。

表1 引物及探針序列

2.2 反應(yīng)條件優(yōu)化

以Puc57-PHEVn為模板，采用“四因素三水平”正交試驗(yàn)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 反應(yīng)，得出最佳反應(yīng)條件為PHEV-f、PHEV-r 終濃度均為0.9 μmol/L，probe 終濃度為0.25 μmol/L，退火溫度為56 ℃時(shí)，熒光信號(hào)最強(qiáng)，起峰較早，擴(kuò)增曲線最明顯（圖1）。

圖1 反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果

2.3 敏感性和特異性

篩選的引物和探針在優(yōu)化的反應(yīng)條件下，檢測(cè)的Puc57-PHEVn 靈敏度為10-6ng/μL。按照公式DNA 拷貝數(shù)/μL=[6.02×1023×DNA 濃度（ng/μL）×10-9]/（DNA 堿基數(shù)×660），計(jì)算出的拷貝數(shù)為224 拷貝/μL（圖2）。標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3，擴(kuò)增效率E=93.6%，R2=0.998。特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，僅有陽性質(zhì)粒Puc57-PHEVn 有明顯擴(kuò)增曲線，上述其他病毒及陰性對(duì)照均未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線（圖4）。

2.4 臨床樣品檢測(cè)

圖3 PHEV 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4 PHEV 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 特異性試驗(yàn)結(jié)果

Ct ≤36 且出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線，判為陽性；36 ＜Ct ＜40 且出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線，重復(fù)檢測(cè)仍為陽性，則判為陽性，否則為陰性；無Ct 值且無擴(kuò)增曲線，判為陰性。用建立的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR，對(duì)233 份發(fā)病豬組織樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果18 份為陽性，而巢式RT-PCR擴(kuò)增并測(cè)序陽性的為14份（表2），兩種方法符合率為98.3%。部分巢式RT-PCR結(jié)果見圖5，最終擴(kuò)增片段為110 bp。

表2 兩種方法臨床樣品檢測(cè)結(jié)果 單位：份

圖5 巢式RT-PCR 檢測(cè)部分樣品電泳圖

3 討論

PHEV 已在世界范圍內(nèi)流行[5]，其基因組的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及其獨(dú)特的套式系列轉(zhuǎn)錄方式?jīng)Q定其容易發(fā)生變異和進(jìn)化，致使其致病性和抗原性復(fù)雜多變[1]。雖然本研究在采自山東、廣西、河南、江西等地的樣品中均檢出陽性，但該病臨床暴發(fā)的報(bào)道卻不多。豬群感染PHEV 后，3～4 周齡仔豬較易出現(xiàn)臨床癥狀，而母豬及育肥豬可針對(duì)病毒產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫，母豬還可通過初乳對(duì)仔豬提供免疫保護(hù)，這可能是世界范圍內(nèi)PHEV 臨床暴發(fā)并不多的原因[3，6-7]。我國(guó)僅吉林省和臺(tái)灣地區(qū)報(bào)道過該病的暴發(fā)[8-10]。本研究所用臨床樣品為發(fā)病豬組織樣品，在檢出PHEV 的同時(shí)，均有PRRSV、PRV或PEDV等病毒檢出。PHEV 與這些病原的相關(guān)性仍需進(jìn)一步研究。因此，隨著病毒的變異及養(yǎng)殖模式的變化[2-3]，PHEV 對(duì)豬群仍有一定的威脅。

目前，國(guó)內(nèi)外已建立了針對(duì)PHEV 的RTPCR[6，9]及巢式RT-PCR 方法[2]，但這些方法均耗時(shí)較長(zhǎng)。臧德躍等[11]根據(jù)PHEV S 蛋白基因建立了SYBR Green I 熒光定量RT-PCR 方法。該方法具有快速、特異、敏感和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，為疾病早期快速診斷提供了良好的技術(shù)手段。目前國(guó)內(nèi)尚未有PHEV 探針法熒光定量RT-PCR 方法的報(bào)道。本研究根據(jù)N 蛋白基因建立的PHEV 熒光定量RT-PCR 探針法，對(duì)陽性質(zhì)粒的檢測(cè)下限達(dá)10-6ng/μL，即224 拷貝/μL。將該方法與巢式RTPCR 同步應(yīng)用于臨床檢測(cè)，結(jié)果兩種方法的符合率達(dá)98.3%，準(zhǔn)確篩查出巢式RT-PCR 并測(cè)序陽性的14 份樣品，且實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 檢出率為7.7%（18/233），高于巢式RT-PCR 的6.0%（14/233），敏感性和重復(fù)性均較好。該方法的建立補(bǔ)充了現(xiàn)有PHEV 的分子生物學(xué)檢測(cè)方法，為該病的有效防控提供了技術(shù)支撐。