侯小林，吳桐忠，李 偉，張星星，黃佐興，黃 新，韓猛立

（1.新疆生產(chǎn)建設兵團第十師北屯市畜牧獸醫(yī)工作站，新疆北屯 836000；2.新疆農(nóng)墾科學院畜牧獸醫(yī)研究所，新疆石河子 832000）

肉牛運輸應激綜合征（transport stress syndrome of beef cattle，TSSBC）俗稱“爛肺病”，是指因長途販運過程中出現(xiàn)多種應激原，如熱、冷、風、雨、饑、渴、擠壓、驚嚇、顛簸、合群、調(diào)料、體力耗費、環(huán)境改變、潛在疾病等，導致機體抵抗力下降，病原微生物，如支原體、巴氏桿菌、肺炎球菌、大腸桿菌等趁虛而入，引起呼吸道、消化道乃至全身病理性反應的綜合征候群，如體溫升高、精神沉郁、食欲減退、被毛粗亂、咳嗽、氣喘、流黏性或膿性鼻液、拉稀、血便、關節(jié)炎、結膜炎、極度消瘦，甚至衰竭死亡[1-3]。在沒有專業(yè)指導和提前預防的情況下，不同地區(qū)間調(diào)運的牲畜，經(jīng)過長途運輸?shù)竭_目的地后，由于運輸過程的多樣性、復雜性等，會出現(xiàn)不同程度的發(fā)病。

2019 年新疆兵團第十師某基層團場購自東北地區(qū)某地的12～14月齡西門塔爾后備生產(chǎn)母牛到場3～5 d 后集中發(fā)病，主要臨床表現(xiàn)為體溫升高（41.2～41.7 ℃）、精神沉郁、流涎、食欲廢絕、反芻停止，繼而腹痛、下痢、干咳、腹式呼吸，牛只臨死前體溫下降、呼吸困難；病程較短，一般為3～5 d，發(fā)病率為25.11%（169/673），病死率為81.65%（138/169），多數(shù)為急性死亡，治愈牛只多數(shù)后期生長不良。本研究應用常規(guī)細菌分離鑒定、分子生物學技術和血清學技術，明確引起長途運輸肉牛發(fā)生不明原因大規(guī)模死亡的病原因素，掌握運輸應激誘發(fā)動物發(fā)病的臨床特點和致病特性，為后續(xù)制定綜合防控措施提供技術支撐和實踐指導。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料與標準菌株 無菌采集病死牛心血、肺臟、肝臟、淋巴結等病料，-20 ℃冷凍備用。標準牛多殺性巴氏桿菌（CVCC393，簡稱標準株），購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑 5%綿羊血液瓊脂平板培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯，TaqDNA 聚合酶、dNTP、DNA 質(zhì)粒提取試劑盒、pMD 19-T（simple）、DL 2 000 DNA Marker，購自寶生物工程（大連）有限公司；快速革蘭氏染色液、瑞氏-姬姆薩染色液，購自珠海貝索生物技術有限公司。VITEK 2 COMPACT 全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)及其配套細菌生化鑒定卡，為法國生物梅里埃公司產(chǎn)品。臨床常用新藥敏紙片，購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.1.3 引物合成 參照Townsend等[4]、Hoelzle等[5]、韓猛立等[6]、徐淑菲等[7]的方法，合成多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida，Pm），牛支原體（Mycoplasma bovis，M.bovis），牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV），牛傳染性鼻氣管炎病毒（bovine infectious rhinotracheitis virus，IBRV）的擴增引物，由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列及擴增片段大小見表1。

表1 4 種病原的PCR 擴增引物序列

1.2 方法

1.2.1 解剖和染色鏡檢 剖檢病牛，將病料組織觸片，如心血、肺臟、肝臟，分別進行革蘭氏和瑞氏染色鏡檢，觀察其形態(tài)特征。

1.2.2 分離培養(yǎng) 將無菌采集的病死牛心血、肺臟、肝臟組織樣品分別接種于營養(yǎng)肉湯，37 ℃恒溫培養(yǎng)16～20 h 后，再接種于麥康凱瓊脂平板、5%綿羊血瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，觀察不同培養(yǎng)基上的生長情況、菌落形態(tài)及溶血情況。

1.2.3 生化鑒定 挑取典型菌落進行分離純化，聯(lián)合應用常規(guī)生化鑒定與全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)鑒定。

1.2.4 支原體和相關病毒PCR 鑒定 將肺臟組織參照文獻[8-9]報道的辦法進行前期處理，應用PPLO 固體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，挑取典型菌落進行特異性PCR 擴增；對采集的病牛血液參照文獻[6-7]中的方法進行BVDV、IBRV 的PCR 檢測。

1.2.5 藥敏試驗 按照常規(guī)方法進行，使用杭州濱河微生物試劑有限公司生產(chǎn)的臨床常用藥敏紙片，采用紙片瓊脂擴散法（K-B 法）進行藥物敏感性試驗。

2 結果與分析

2.1 臨床剖解

病死牛剖解病變主要表現(xiàn)為：肺部淤血腫大，呈暗紅色（圖1-A），切開后流出纖維素性浸出液，切面呈大理石狀，部分出現(xiàn)胸壁粘連，肺心葉有多個黃豆大、黃白色壞死灶，胸腔積液；肝臟腫大，表面有灰白色壞死灶；膽囊顯著腫大；心外膜、心冠脂肪有出血斑點，尤以心耳出血明顯（圖1-B）；淋巴結水腫、出血，腸道廣泛性出血。

圖1 病死牛剖解病理變化

2.2 染色鏡檢

對采集的心血、肺臟、肝臟、脾臟組織涂片瑞氏染色鏡檢。從心血、肺臟涂片中發(fā)現(xiàn)單一的、兩極濃染的球桿菌，可見明顯的莢膜；心血涂片可見紅細胞形態(tài)不規(guī)則，中間出現(xiàn)空洞，紅細胞表面附著大量蟲體，呈鏈狀排列，紅細胞呈星形（圖2）。初步判定為，巴氏桿菌與附紅細胞體的混合感染。

圖2 病死牛血液涂片染色結果

2.3 細菌鑒定

將從肺臟組織中分離到的菌落進行分離純化，經(jīng)全自動微生物鑒定儀鑒定，發(fā)現(xiàn)生化反應結果符合牛多殺性巴氏桿菌特性（可信度為99%），初步鑒定為牛多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida，Pm）；對分離純化的菌落進行PCR 特異性擴增，瓊脂糖凝膠電泳，結果發(fā)現(xiàn)在460 bp 處均出現(xiàn)與目的片段一致的條帶（圖3），測序結果與GeneBank 數(shù)據(jù)庫中多殺性巴氏桿菌同源性達99%以上。

圖3 多殺性巴氏桿菌PCR 擴增電泳圖

2.4 支原體PCR 鑒定

將肺臟組織應用PPLO 固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，可觀察到煎荷包蛋樣菌落。典型菌落的特異性PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，獲得了與預期大小一致的238 bp 片段（圖4），證明分離株為牛支原體；對陽性片段回收測序，發(fā)現(xiàn)分離株與牛支原體國際標準株PG45（GeneBank 號CP002188）、地方株FJ-HJ 株（GeneBank 號KX230478）、HB0801 株（GeneBank 號CP007591）、CQ-W70（GeneBank 號CP005933）16SrRNA 基因序列相似性介于96.9%～98.5%。

圖4 牛支原體分離株PCR 擴增電泳圖

2.5 IBRV 和BVDV 的PCR 檢測

病牛血液BVDV、IBRV PCR 檢測結果顯示，未獲得目的條帶（圖5），檢測結果為陰性。

圖5 IBRV 和BVDV 的PCR 擴增電泳圖

2.6 藥敏試驗

按照CLSI 標準和配套的試劑盒操作步驟及判定標準，對分離菌株進行藥敏試驗。結果顯示，分離菌株均表現(xiàn)出不同程度的耐藥性：牛巴氏桿菌對環(huán)丙沙星、氟苯尼考、阿奇霉素、頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢他啶敏感，牛支原體對左氧氟沙星、阿奇霉素敏感，兩種病原對臨床普遍使用的青霉素、磺胺類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類等表現(xiàn)出全部耐藥（表2）。

表2 牛巴氏桿菌和牛支原體藥敏試驗結果

2.7 綜合診斷及治療

根據(jù)細菌學檢驗結果、病理解剖變化特征，結合現(xiàn)場發(fā)病情況、臨床癥狀觀察，以及牛只經(jīng)長途運輸?shù)那樾危卸ù舜闻Ｖ话l(fā)病死亡系由長途運輸導致牛機體免疫力下降，擾亂了牛機體的細胞免疫和體液免疫，繼而混合感染巴氏桿菌（多殺性巴氏桿菌）、牛支原體和附紅細胞體，引起急性敗血癥所致。對出現(xiàn)肺炎癥狀的發(fā)病牛只，按照抗菌消炎（結合市售獸藥情況，選用泰樂菌素和環(huán)丙沙星）、解熱鎮(zhèn)痛，配合強心補液，提高機體免疫力和抗過敏的原則進行治療，發(fā)現(xiàn)對處于發(fā)病期的牛治愈率不高，但對同群其余牛只治療效果較佳。經(jīng)過28 d的處理和治療，該牛群發(fā)病情況得到有效控制，沒有新發(fā)病例出現(xiàn)。

3 討論

為改善肉牛養(yǎng)殖品種，新疆建設兵團部分農(nóng)牧團場相繼從東北地區(qū)外購良種生產(chǎn)母牛，以解決肉牛產(chǎn)業(yè)發(fā)展緩慢的現(xiàn)狀。此次大規(guī)模長距離外購生產(chǎn)母畜事件中，該場前期做了諸多準備，包括實地考察、挑選牛只、聯(lián)系車輛、途中休息、飼養(yǎng)圈舍規(guī)劃、飼料儲備、技術人員安排等，但依然出現(xiàn)運輸應激綜合征，造成大量肉牛發(fā)病死亡，經(jīng)濟損失巨大。

近年來，牛肉需求量越來越大，導致許多地區(qū)肉牛供給不足，需要從外地經(jīng)長途運輸引進。而運輸應激綜合征嚴重影響了我國肉牛產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。動物在運輸過程中，遭遇驅(qū)趕、裝卸、震動、擁擠、噪聲、溫濕度變化、禁水限食、疲勞等持續(xù)強烈的刺激后，會出現(xiàn)運輸應激綜合征，導致機體生理機能紊亂，抵抗力下降，此時病原微生物趁機侵入宿主體內(nèi)，會引起動物發(fā)病死亡[7，10-12]。據(jù)國內(nèi)學者報道[2，13-15]：長途運輸引發(fā)肉牛運輸應激綜合征的發(fā)病率約為80%，病死率達40%以上；在牛群轉運過程中，運輸應激常誘發(fā)以牛支原體肺炎為主的傳染性疾病，發(fā)病率在80%以上，病死率達10%以上，嚴重的甚至高達40%～60%，可造成巨大的經(jīng)濟損失。

國外學者認為：運輸集裝箱卡車設計、儲存密度、駕駛員駕駛技術、道路質(zhì)量、通風情況和環(huán)境溫度是評估運輸條件時需要考慮的容易引起運輸應激綜合征的重要因素[16]；運輸過程中發(fā)生的生理變化始于脫水、飼料攝入不足、組織損傷[17]、吸入煙霧[18-19]以及生理和心理壓力。國外學者已開展了運輸應激對鼻咽部微生物群[20-21]、皮質(zhì)醇[22-23]、中性粒細胞[24-25]、機體免疫應答[24，26-27]、急性期蛋白[23，28]以及基因表達[28-30]等多方面的影響。而國內(nèi)研究主要集中在病例分析[31-32]、生理指標和生化免疫指標[10，33]、對應激蛋白與miRNA 的影響[34-37]、綜合防治和抗應激處理技術[14，38-39]等方面。

Moore等[40]分析了2010—2012 年自澳大利亞運往中東、俄羅斯和中國的20 次活牛長途運輸中215 頭牛死亡的病因：最主要的是呼吸道疾?。?9.4%），其次是跛行（12.2%）、酮?。?.7%）、敗血癥（6.1%）和腸道疾?。?.6%）；2/3 的病牛肺組織有病變，其中72%發(fā)生細菌感染，3%發(fā)生病毒感染，22%發(fā)生細菌、病毒混合感染，3%原因不明；相關病毒主要是牛冠狀病毒、皰疹病毒Ⅰ型、病毒性腹瀉病毒、呼吸道合胞體病毒和副流感病毒3 型等，其他病原微生物主要有支原體、睡眠嗜組織菌、溶血性曼氏桿菌和多殺性巴氏桿菌等。

國內(nèi)研究[41-42]發(fā)現(xiàn)：肉牛運輸應激綜合征常表現(xiàn)為呼吸道疾病，其次為腹瀉和關節(jié)腫脹；感染病原主要為支原體和巴氏桿菌。姚永進等[8]、楊銘偉等[9]在新疆石河子、博樂、奎屯、塔城等地區(qū)牛場因肺炎死亡的犢牛肺臟組織中，分離獲得牛支原體，但多數(shù)分離自犢奶牛及3月齡內(nèi)的乳用犢牛；張銳等[43]確診新疆北屯市某牛場新引進肉犢牛發(fā)生肺炎死亡的病原為牛支原體，推測可能與牛群發(fā)病前的長途運輸應激有關，說明運輸應激不僅可誘發(fā)牛巴氏桿菌病，也可導致牛支原體肺炎暴發(fā)。由此可見，牛引種運輸需要重點加強呼吸道疾病的管理與處置。

為降低運輸應激對肉牛健康的影響，需要綜合考慮運輸?shù)恼麄€過程和環(huán)節(jié)，如運輸前根據(jù)牛群基本情況和自身需要挑選高品質(zhì)健康肉牛，不能從疫區(qū)引進肉牛，有條件的可以進行主要疫病的流行病學調(diào)查；引進后加強飼養(yǎng)管理與保健，提高動物機體免疫力和體抗力，防止病原微生物入侵；提前改變飼喂方式，以適應長距離運輸需要，做好環(huán)境和車輛的消毒等。運輸過程中需要注意車輛的選擇以及車速、路線規(guī)劃、中途休息與飼喂、裝車密度、運輸時間和季節(jié)、安全防護與病牛治療等。到達目的地后要小群飼養(yǎng)，隔離觀察，做好過渡期的飼養(yǎng)管理和營養(yǎng)需求，注意保持牛舍衛(wèi)生清潔、通風和消毒，待動物體況穩(wěn)定并進行驅(qū)蟲后，再混群飼養(yǎng)。當肉牛出現(xiàn)運輸應激綜合征時，應先隔離病牛，對污染的圈舍、墊料、用具和受威脅的牛群進行消毒處理，同時進行臨床診斷和實驗室檢測，查明發(fā)病原因，采取對因治療和對癥治療。建議推廣實施“自繁自養(yǎng)”模式，擴大肉牛基礎母牛群，增加各地尤其是傳統(tǒng)優(yōu)勢地區(qū)能繁母牛的存欄量。

4 結論

通過現(xiàn)場調(diào)查，結合臨床癥狀、臨床剖解和發(fā)病情況，初步診斷此次大規(guī)模外購生產(chǎn)母畜到達目的地后發(fā)病死亡的原因是長途運輸引起的應激綜合征；經(jīng)實驗室細菌分離鑒定和分子生物學檢測，確定引發(fā)應激綜合征的主要致病菌為巴氏桿菌和支原體，并伴有附紅細胞體的混合感染；對癥治療、抗菌消炎、提高機體免疫力和抗過敏的治療原則，對發(fā)病中后期牛群的治療效果不佳，但對同群其余牛效果顯著。此病例的診治，為長途調(diào)運生產(chǎn)母畜時，降低類似事件的發(fā)生提供了一定的理論基礎和實踐指導。