蔣益忠，夏天爽，辛海量，金玉娥，蔣益萍，薛黎明 （. 浙江省東陽市中醫(yī)院，浙江 東陽 05；. 海軍軍醫(yī)大學藥學院生藥學教研室，上海 004；. 上海市疾病預防控制中心化學品毒性檢定所，上海 006）

維生素K(VK)，又稱凝血維生素，是一類具有葉綠醌生物活性的脂溶性維生素。除具有凝血功能外，維生素K 還能促進骨代謝，防治骨質(zhì)疏松癥，天然VK1和VK2(主要活性體為MK4和MK7)可單獨或協(xié)同其他抗骨質(zhì)疏松藥物治療骨質(zhì)疏松癥[1-4]，人工合成的VK3也有少量抗骨質(zhì)疏松研究報道[5-6]，然而，不同維生素K 的抗骨質(zhì)疏松作用的比較研究非常有限。有研究發(fā)現(xiàn)維生素K 具有促進骨形成和抑制骨吸收的雙向調(diào)節(jié)機制[7]，藥理研究發(fā)現(xiàn)VK1、MK4和MK7能顯著促進小鼠成骨細胞MC3T3-E1 增殖和堿性磷酸酶(ALP)活性[8]，同時報道VK1、MK4和MK7也能顯著抑制RANKL 誘導骨髓單核細胞分化的破骨細胞抗酒石酸酸性磷酸酶 (TRAP)基因和組織蛋白酶 K(CTSK)mRNA 表達[9]。臨床報道發(fā)現(xiàn)VK2能顯著降低絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的TRAP 和CTSK 表達[10]。CTSK是骨吸收過程中的關(guān)鍵溶骨活性酶[11]，與粘多糖(glycosaminoglycan, GAG)，如 硫 酸 軟 骨 素(CSA)，形成一種高分子量的復合物，可將膠原蛋白降解。目前尚未有VK 對CTSK 骨膠原降解的研究報道。本研究以新生大鼠顱蓋骨分離成骨細胞和巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)和核因子κB 受體活化因子配體(RANKL)誘導骨髓單核細胞的破骨細胞為模型[12]，系統(tǒng)比較VK1、MK4、MK7和VK3對成骨細胞增殖和ALP 活性、破骨細胞分化、TRAP 活性和CTSK 降解膠原活性的影響。通過比較不同VK 抗骨質(zhì)疏松作用，對臨床選用合適的VK 營養(yǎng)補充劑、指導人群VK 膳食補充，以滿足我國人群骨健康需求具有重要意義。

1 材料

新生3 d 的SD 大鼠，雌雄不限，購自上海斯萊克實驗動物有限公司[SCXK（滬）2012-0002]；II 型膠原酶、胰蛋白酶、特級胎牛血清、α-MEM 培養(yǎng)基（美國Gibco 公司）；CellTriter-blue 試劑(美國Promega?)，核刺激因子受體的配體(receptor for activation of nuclear factor kappa B ligand, RANKL，400-30)、巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor, M-CSF， 400-28)購 自PEPROTECH 公 司， 淋 巴 細 胞 分 離 液Ficoll-Paque 密度梯度液(GE)購自上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司；TRACP 染色試劑盒、Benzyloxycarbonyl-Phe-Arg-7-amido-4-methylcoumarin (Z-FR-MCA)購自日本W(wǎng)AKO 公司；L-3-carboxytrans-2-3-epoxypropionyl-leucylamido-(4guanidino)-butane(E-64)、硫酸軟骨素A (CSA)胃蛋白酶、組織蛋白酶K 抑制劑奧當卡替(odanacatib, ODN)、VK1、MK4、MK7和VK3，購自Sigma 公司；I 型膠原（美國Affymetrix 公司）；牛血清白蛋白、β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸、多聚甲醛等試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 成骨細胞增殖和ALP 活性

實驗室自建原代成骨細胞培養(yǎng)方法[12]。取新生3 d的SD 大鼠5 只，在無菌條件下取其顱頂蓋骨，去除骨膜、血管及結(jié)締組織，用D-Hanks 液沖洗干凈，用0.25%的胰蛋白酶37 ℃消化30 min，再用0.05%胰蛋白酶及3 mg/ml 的II 型膠原酶37 ℃消化1 h，經(jīng)100 目濾網(wǎng)過濾，1 000 r/min 離心10 min，即為新鮮的成骨細胞，加入10%胎牛血清的α-MEM 培養(yǎng)基，置37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱。取第四代大鼠顱蓋骨成骨細胞，消化分離出來，以α-MEM培養(yǎng)基配制成濃度為2×104/ml 的細胞懸液，以100 μl/孔接種于96 孔培養(yǎng)板，設12 個藥物組，分別為1、0.1 和0.01 μmol/L 的VK1、MK4、MK7和VK3，每組選取1 個藥物濃度加入1、0.1 和0.01 μmol/L 的VK1、MK4、MK7和VK3，培養(yǎng)48 h，用MTT 法檢測細胞增殖活性。ALP 活性需要連續(xù)培養(yǎng)6 d 后，用100 μl 50 mmol/L 的二乙醇胺，50 μl 2.5 mmol/L的對硝基苯酚磷酸二鈉，37 ℃反應30 min 后，用0.3 mol/L 的NaOH 終止反應，于波長405 nm 處測得吸光度值[12-13]。

2.2 成骨細胞骨結(jié)節(jié)面積

取成骨細胞第三代細胞，按每孔5×104的細胞數(shù)接種于12 孔板內(nèi)，α-MEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，換骨結(jié)節(jié)誘導培養(yǎng)基(0.1%BSA，10 nmol/L 地塞米松，10 mmol/L β-甘油磷酸鈉和50 μg/ml 抗壞血酸以及10%胎牛血清的α-MEM 培養(yǎng)基)，加入1 μmol/L的VK1、MK4、MK7和VK3后，每3 d 換藥1 次，連續(xù)培養(yǎng)觀察14 d 后，用0.1%茜素紅-Tris-Hcl 染液(pH 8.3)染色。染色前，用預冷的10%中性甲醛緩沖液固定10 min，PBS 沖洗3 次。加入0.1%茜素紅-Tris-Hcl 染液(pH 8.3)，37 ℃下染色30 min。蒸餾水沖洗，干燥，封片。倒置相差顯微鏡(Leica DMI 3000)下進行觀察并隨機拍照10 張，用image-Pro Plus (IPP 6.0)分析圖片，得出每張圖片骨結(jié)節(jié)面積[13]。

2.3 破骨細胞活力和數(shù)目

取新生3 d 的SD 大鼠脛骨，用α-MEM 培養(yǎng)基沖洗骨髓腔以收集骨髓細胞，加入等量Ficoll 試劑分離骨髓單核細胞，用含有25 ng/ml M-CSF、25 ng/ml RANKL 的細胞因子和10%胎牛血清的α-MEM 培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，每3 d 換液1 次，6 d 后破骨細胞分化成熟。細胞成熟后，以1×105/ml 接種于96 孔板，加入1、0.1 和0.01 μmol/L 的VK1、MK4、MK7和VK3。繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后，取100 μl 培養(yǎng)基，加入20 μl CellTriter-blue 試劑，輕輕晃10 s 混勻，37 ℃孵育30 min 后，將96 孔板置于熒光分光光度計，檢測細胞懸液熒光強度(發(fā)散光波長560 nm，吸收光波長590 nm)。

2.4 破骨細胞TRAP 活性

成熟破骨細胞以1×105/ml 接種于96 孔板內(nèi)，加入1、0.1 和0.01 μmol/L 的VK1、MK4、MK7和VK3，培養(yǎng)48 h 后，棄上清液，PBS 沖洗2 次，20 μl 0.1%Triton X-100 室溫破碎細胞15 min，加入100 μl反應液(0.4 g 對硝基苯基磷酸二鈉，去離子水溶解后加入2.0 g 酒石酸鉀鈉，加水溶解至150 ml，HCl 調(diào)節(jié)pH 至3.5，再加水定容至200 ml)，于37 ℃反應30 min，迅速加入100 μl 1 mol/L 的NaOH 終止反應，于波長405 nm 處測定其吸光度值[14]。

2.5 抑制CTSK 與Z-FR-MCA 底物

25 μmol/L 的VK1、MK4、MK7、VK3和1 μmol/L陽性藥Odanacatib 用100 mmol/L 醋酸鈉緩沖液(pH5.5， 包 含 2.5 mmol/L DTT， 和 2.5 mmol/L EDTA)稀釋至濃度為25 μmol/L 加入96 孔板，最終反應容量為0.2 ml，加入終濃度為5 nmol/L 的CTSK 孵育5 min，加入5 μl 底物1 mmol/L 的ZFR-MCA 溶液開始反應，檢測5 min 熒光信號(發(fā)散光波長460 nm，吸收光波長355 nm)。實驗設陰性對照，陽性對照(1 μmol/L E-64)。

計算公式：抑制率（%）=100-(1-Vi/V0)。

Vi和V0分別表示存在和不存在VK 情況下，記錄熒光信號強度隨時間變化斜率slope 值[11]。

2.6 凝膠電泳法檢測CTSK 降解可溶性膠原

可溶性I 型膠原溶解在100 mmol/L 醋酸鈉緩沖液(pH5.5，包含2.5 mmol/L DTT 和2.5 mmol/L EDTA)，最終I 型膠原濃度為0.6 mg/ml，加入終濃度100 μmol/L 的VK1、MK4、MK7和VK3及10 μmol/L陽性對照藥Odanacatib，依次將CTSK 和CSA(終濃度分別為400 和200 nmol/L)加入含有I 型膠原蛋白的反應液中，使總反應液容量為50 μl。混勻，28 ℃孵 育4 h，取 出 后 加 入1 μl 的100 μmol/L E64 終止反應。采用10%的SDS-PAGE 凝膠電泳分離，卡馬斯亮藍染色20 min，用乙酸-甲醇(4∶1)脫色。I 型膠原的α1 條帶的灰度用Gene Snap(Syngene Inc.Frederick，MD)軟件進行定量分析[14]。

2.7 統(tǒng)計學分析

每組實驗重復3 次。采用SPSS 軟件經(jīng)ANOVA方差分析檢驗(α=0.05)，再用SNK 對每兩組進行兩兩比較，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 維生素K 對成骨細胞增殖、ALP 活性和骨結(jié)節(jié)形成的影響

VK1和VK3在0.01～1 μmol/L 濃度范圍內(nèi)對成骨細胞增殖和ALP 活性均未有影響(圖1A、1B)。MK4在0.01 和0.1 μmol/L 濃度顯著促進了成骨細胞增殖活性，分別提高了15.5%和23.0%(P＜0.05)，而MK7分別提高了25.1%和18.4%。MK4和MK7在1 μmol/L 顯著提高了ALP 活性(P＜0.05)，促進率分別為30.2%和25.7%。成骨細胞在骨結(jié)節(jié)誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)14 d 后，經(jīng)茜素紅染色液染色，骨結(jié)節(jié)處形成紅色鈣化晶體，骨結(jié)節(jié)的面積代表了成骨細胞的鈣化程度(圖1C)，結(jié)果顯示MK4和MK7在1 μmol/L 濃度時顯著提高了骨結(jié)節(jié)形成面積(P＜0.05)，分別增加25.2%和34.0%，VK3顯著抑制了骨結(jié)節(jié)的形成。

3.2 維生素K 對破骨細胞活力和TRAP 活性的影響

由 圖2A 可 得，VK1、VK3、MK4和MK7在0.01～1 μmol/L 濃度對破骨細胞代謝活力均無影響，對破骨細胞無毒性。VK1、MK4和MK7在1 μmol/L 表現(xiàn)出抑制TRAP 活性，抑制率分別為27.4%、54.0%和35.0%，MK4在0.01 和0.11 μmol/L濃度顯著降低了破骨細胞TRAP 活性(P＜0.01)，分別降低了50%和41%，MK7在0.1 μmol/L 濃度時，TRAP 活性顯著降低26.8%(圖2B)。

3.3 維生素K 對CTSK 酶的抑制作用

本研究考察VK1、VK3、MK4和MK7抑制CTSK 與Z-FR-MCA 底物結(jié)合活性。圖3A 結(jié)果顯示，1 μmol/L 的ODN 抑制了CTSK 與Z-FRMCA 底 物 結(jié) 合 效 率 達98.3%，而25 μmol/L 的VK3、MK4、MK7和VK1抑 制 率 分 別 為0.3%、58.9%、16.6%和9.4%。與空白膠原相比，VK3、MK4、MK7和VK1在100 μmol/L 抑制膠原降解效率達30.8%、73.8%、18.4%和19.2% (圖3B、3C)，僅有MK4和ODN 超過60%的抑制率，與未加CSA 的CTSK 陰性對比，抑制率達38.8%、93.0%、23.1%和24.2%。與空白膠原組對比，陽性抑制劑ODN 在1 μmol/L 的 抑 制 率 達77.3%，與 未 加CSA 的CTSK 陰性對比，抑制率達到99.0%。

4 討論

研究報道VK1、MK4和MK7能顯著促進成骨細胞活性和抑制破骨細胞活性[9-10]。臨床報道服用高含量維生素K1能夠降低髖部骨折風險和提高髖部及腰椎部骨密度，可延緩50～60 歲絕經(jīng)后女性的骨丟失[2]。同時藥理研究發(fā)現(xiàn)VK3顯著促進去卵巢大鼠的骨密度和改善骨質(zhì)疏松相關(guān)指標[5]。而本研究并未發(fā)現(xiàn)VK1和VK3具有促進成骨細胞和抑制破骨細胞的作用，可能原因是選擇的篩選濃度過低所致。MK4和MK7在1 μmol/L 能促進成骨細胞增殖和礦化作用，二者并沒有顯著差異。但在抑制骨吸收作用方面，MK4相較于MK7在相同濃度，有更顯著的抑制TRAP 活性的作用。

CTSK 是破骨細胞發(fā)揮骨吸收作用的關(guān)鍵靶標酶，選擇性地大量表達于破骨細胞，其生理作用底物正是在有機骨基質(zhì)中含量達95%的I 型膠原[11]。我們研究發(fā)現(xiàn)，在相同濃度，只有MK4能顯著抑制其底物骨膠原降解和人工合成底物Z-FR-MCA 的活性。

日本早在1995 年首次將MK4作為治療骨質(zhì)疏松的藥物應用[15]，2011 年MK4錄入我國《原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥診療指南》[16]。因此，我們認為MK4是人體內(nèi)源性營養(yǎng)物質(zhì)，安全性高，適用于各年齡人群作為營養(yǎng)補充劑使用。MK7具有促進骨形成作用，在體內(nèi)也可以分解成MK4發(fā)揮作用，適合作為營養(yǎng)食品補充劑。