張宗鵬，王治國，石慶學(xué)，張國旭，霍 花 （北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院：. 核醫(yī)學(xué)科, . 藥物臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)辦公室，遼寧沈陽 110840）

氟馬西尼（flumazenil，F(xiàn)MZ）作為中樞苯二氮?受體（CBZR）拮抗劑，具有高度特異性和選擇性，通過拮抗苯二氮?類藥物與其受體的結(jié)合，用于逆轉(zhuǎn)其所致的中樞鎮(zhèn)靜作用[1]。11C-氟馬西尼（11Cflumazenil，11C-FMZ）可通過PET/CT 顯像定量分析CBZR 與γ 氨基丁酸（GABA）受體、氯離子通道偶聯(lián)形成的復(fù)合受體GABA/CBZR，用于癲癇病灶及遺傳性舞蹈病的檢查[2]。但是11C 的半衰期只有20.38 min，制備結(jié)束后如不及時(shí)注射入受檢者體內(nèi)，每摩爾(mol)藥液的放射性活度，即比活度會(huì)很快降低。11C-FMZ 在體內(nèi)經(jīng)肝酶水解，部分轉(zhuǎn)變?yōu)闊oCBZR 拮抗活性的羧酸代謝物[3]，見圖1。不同比活度的11C-FMZ 在體內(nèi)代謝有無差異，未見文獻(xiàn)報(bào)告。本研究通過測(cè)定不同比活度的11C-FMZ在體內(nèi)的代謝變化，擬為11C-FMZ 的臨床合理應(yīng)用提供一定依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

Minitrace 回旋加速器、TRACELab FXc 放射性藥物合成系統(tǒng)（美國GE 公司）；HPLC 半制備分析系統(tǒng)、紫外檢測(cè)器、Sep-Pak C18層析柱（美國Waters 公司）；LB508 型放射性檢測(cè)器（德國Berthold 公司）；CRC-15R 型活度檢測(cè)器（美國Capintec 公 司） ； Millex-GS 無 菌 濾 膜（ 美 國Capintec 公司）；Wallac 1470 WIZARD γ 計(jì)數(shù)器（芬蘭PE 公司），WD-9405B 型水平搖床（北京沃德生物醫(yī)學(xué)儀器公司），高速低溫離心機(jī)（美國Therma 公司）。

去甲基氟馬西尼、標(biāo)準(zhǔn)品氟馬西尼(江蘇華益科技有限公司)；碘（美國Sigma-Aldrich 公司）；氫氣、氦氣、氮?dú)狻?%氧-氮混合氣、鹽酸、磷酸、無水乙醇、無水乙腈、二甲基甲酰胺（DMF）、氫化鈉（NaH）、0.9%氯化鈉（中國醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司）；三氟磺酸銀粉（Ag-Triflate，自制）。商品化溶劑皆為市售分析純或化學(xué)純。

1.2 研究對(duì)象

選擇2019 年5 月至10 月北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科10 名健康受試者，其中，男性5 名，女性5 名，平均年齡（41.7±4.7）歲，平均體重（69.3±6.8）kg。所有受試者均進(jìn)行系統(tǒng)的體格檢查，確認(rèn)無基礎(chǔ)疾病且試驗(yàn)前1 個(gè)月內(nèi)無藥物服用史，并簽署了知情同意書。

1.3 研究方法

1.3.111C-FMZ 的合成

首先使用回旋加速器以1% O2/N2為原料，通過14N（p,α）11C 核反應(yīng)生產(chǎn)11C-CO2，傳輸至藥物合成系統(tǒng)，并以圖2 所示，合成路線轉(zhuǎn)化為11C-三氟甲基磺?；淄椋?1C-Triflate-CH3）[4]。將0.5 mg 去甲基氟馬西尼和1 mg NaH 溶于0.4 ml DMF 于反應(yīng)池中與11C-Triflate-CH3在0 ℃反應(yīng)5 min，升至室溫并加入0.5 mol/L HCl 中和?；旌衔镞M(jìn)入HPLC 進(jìn)行分離純化，分離柱：Nucleosil 100-5 C18，250 mm×10 mm，流 動(dòng) 相：含0.01 mol/L 磷 酸 的22%乙腈溶液，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，流速4 ml/min。收集放射性峰組分，用Sep-Pak C18柱再次分離純化，最后通過0.22 μm 的無菌濾膜過濾得到產(chǎn)物11C-FMZ[5]，如圖3 所示。產(chǎn)品依據(jù)《中國藥典》（2015 年版）進(jìn)行無菌檢測(cè)和內(nèi)毒素含量檢測(cè)。

1.3.2 藥物的注射

首先，在靜息狀態(tài)下通過肘靜脈為10 名受試者注射11C-FMZ 3 ml，經(jīng)活度檢測(cè)器測(cè)量，平均放射性活度為（10.5±2.9）mCi（1 Ci=3.7×1010Bq），放射性比活度以單位物質(zhì)的量所含放射性活度作為定量依據(jù)，平均比活度為（268.3±57.2）×103Ci/mol；2 h 后，再 次 注 射11C-FMZ 3 ml，平 均 活 度 為（10.6±2.8）mCi，此時(shí)藥液已放置5～6 個(gè)半衰期，平均比活度降為（57.8±11.4）×103Ci/mol。兩次注射藥物后均需靜臥60 min，分別在1、2、3、5、10、15、20、30、40、60 min 時(shí)于對(duì)側(cè)肘靜脈抽取血樣。

1.3.3 血漿預(yù)處理與放射性計(jì)數(shù)測(cè)定

取500 μl 血樣于試管中，加入500 μl 緩沖溶液（0.1 mol/L 硼酸，0.05 mol/L 氯化鉀，0.1 mol/L 氫氧化鈉）調(diào)節(jié)pH 至11，再加入1 ml 氯仿，于水平搖床混勻5 min，再以4 000 r/min 離心5 min。取氯仿相和水相各200 μl，使用γ 計(jì)數(shù)器分別測(cè)定兩相1 min 的放射性計(jì)數(shù)（counts per minute，cpm）。

1.4 計(jì)算與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

放射性計(jì)數(shù)首先需經(jīng)衰變公式（公式1）校正以抵消血漿預(yù)處理的耗時(shí)所致的放射性衰減，再計(jì)算各血樣的百分注射劑量率(%ID/L,公式2）及不同比活度下各時(shí)間點(diǎn)11C-FMZ 羧酸代謝物的占比（公式3）。使用SPSS 18.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s）表示，采用配對(duì)樣本均數(shù)t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

I0：抽血時(shí)的cpm，I：測(cè)量時(shí)的cpm，t：抽血與測(cè)量的時(shí)間差 (min)，T：11C 半衰期20.38 min。

首先計(jì)算t/T值，從“衰變計(jì)算表”[6]中查出比值對(duì)應(yīng)的e-λt值。

2 結(jié)果

11C-FMZ 的百分注射劑量率隨時(shí)間呈指數(shù)下降，羧酸代謝物則先升后降并在10 min 后開始超過11C-FMZ，如表1 所示。羧酸代謝物的百分占比隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐步增加，于15 min 后基本趨于穩(wěn)定，且低比活度組的百分占比明顯高于高比活度組，從統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果可以看到，兩組數(shù)據(jù)在15～60 min的區(qū)間存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），如表2 所示。

表1 不同比活度11C-FMZ 注射后在不同時(shí)間的百分注射劑量率（%ID/L）

表2 不同比活度11C-FMZ 的羧酸代謝物在不同時(shí)間百分注射劑量率的占比（%）

3 討論

本研究使用氯仿作為11C-FMZ 及其羧酸代謝物的分離試劑，對(duì)11C-FMZ 的提取效率可達(dá)100%，而代謝物可完全保持在水相中。相關(guān)研究中，TLC 沒有檢測(cè)到除羧酸代謝產(chǎn)物以外的其他放射性代謝物[7]，保證了該方法對(duì)放射性比活度測(cè)定的準(zhǔn)確性。

Debruyne 等[8]研究了進(jìn)食對(duì)11C-FMZ 體內(nèi)代謝的影響，并觀察到進(jìn)食后的代謝率更高，并認(rèn)為是進(jìn)食導(dǎo)致肝臟血流增加，從而導(dǎo)致肝臟提取量高的藥物代謝增加。由于11C-FMZ 主要通過肝臟代謝從體內(nèi)清除，僅0.2%的給藥劑量在尿中以原形排出[9]，因此在PET 研究中，應(yīng)控制飲食條件。

每升血漿中所含的標(biāo)記藥物的百分比與之前的某些定量研究結(jié)果基本一致。Samson 等[10]和Shinotoh 等[11]對(duì)高放射性比活度研究的結(jié)果分別為10 min 時(shí)（2.4±0.9）和（3.7±1.6）%ID/L，20 min 時(shí)（2.1±0.4）和（3.5±1.4）% ID/L。但二者均缺少低放射性比活度及羧酸代謝物的進(jìn)一步研究。本研究中血漿的百分注射劑量率在注射后10 min 左右出現(xiàn)上升，與之前相關(guān)研究結(jié)果相似[11-13]，這可能與標(biāo)記的羧酸代謝物的產(chǎn)生有關(guān)。Klumpers 等認(rèn)為原因是藥物在分布階段暴露于酯酶的某種首過效應(yīng)，這種酯酶在肝臟、腎臟和大腦中大量存在且具有非常廣泛的底物特異性[14]。在狒狒身上進(jìn)行的相關(guān)研究沒有觀察到該現(xiàn)象[8]，這種差異是由于在該物種中羧酸代謝物的標(biāo)記分?jǐn)?shù)較低。本研究中的高、低比活度對(duì)應(yīng)代謝物的占比分別為61%和68%，而狒狒僅為45%。

綜上所述，放射性比活度不同的11C-FMZ 注射后的代謝率存在明顯差異，在PET 相關(guān)研究中應(yīng)盡量避免對(duì)比活度差異過大的同一批受試者進(jìn)行試驗(yàn)，臨床應(yīng)用時(shí)同一患者在復(fù)查時(shí)所采用的比活度也需盡量與初診時(shí)一致，以獲得最佳的圖像對(duì)比價(jià)值。