卜 一，張 碩，錢旭東，王紅梅，竇志杰

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,河北 承德 067000)

缺血性腦血管病致殘率和死亡率高，對(duì)人類健康造成嚴(yán)重危害。腦梗死后新生血管形成可為缺血腦組織供血供氧，縮小梗死灶體積，減少神經(jīng)細(xì)胞損傷，并有助于神經(jīng)功能恢復(fù)[1]。血管生成受多種血管生成因子調(diào)節(jié)，胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白3(insulin-like growth factor-binding protein 3,IGFBP-3)與血管生成關(guān)系密切，在不同疾病中IGFBP-3發(fā)揮作用也不同，在不同疾病中IGFBP-3可具有促進(jìn)血管生成和抑制血管生成作用。KUSHLINSKII等[2]研究發(fā)現(xiàn)：大腸癌患者血清中IGFBP3水平與VEGF表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，可能發(fā)揮抑制血管新生的作用；BAKOPOULOU等[3]研究認(rèn)為：IGFBP3具有促血管生成的作用。但I(xiàn)GFBP-3在腦梗死組織中的表達(dá)情況及其與腦梗死后血管生成的關(guān)系尚不清楚。本研究旨在深入探討腦梗死大鼠缺血腦組織中IGFBP-3表達(dá)水平及其與血管新生的關(guān)系，闡明IGFBP-3在腦梗死血管新生中的作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、主要試劑和儀器健康、清潔級(jí)SD大鼠110只，購(gòu)自北京市醫(yī)療器械檢驗(yàn)所，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(京)2015-0005。ECL發(fā)光液、逆轉(zhuǎn)錄(RT)試劑盒、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒、BCA試劑盒和2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)(美國(guó)Bioworld公司)，TRIzol和水合氯醛(上海碧云天生物技術(shù)公司)，兔抗鼠IGFBP-3多克隆抗體、兔抗鼠血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)多克隆抗體、兔抗鼠CD31多克隆抗體和兔抗鼠α-SMA多克隆抗體等抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)。RT-PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2 大鼠分組和模型建立將110只大鼠分為對(duì)照組30只和模型組80只。模型組大鼠采用LONGA等[4]線栓法建立大腦中動(dòng)脈栓塞缺血大鼠模型：水合氯醛腹腔麻醉大鼠，固定到動(dòng)物手術(shù)臺(tái)上，取頸正中切口，切開(kāi)皮膚、淺筋膜，分離肌肉，暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，雙重結(jié)扎頸外動(dòng)脈及其分支，在頸外動(dòng)脈近分叉處做小切口，從雙重結(jié)中間切斷頸外動(dòng)脈，插入漁線，使?jié)O線繞過(guò)頸總動(dòng)脈分支，進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈，向顱內(nèi)方向推進(jìn)，推進(jìn)長(zhǎng)度約18 mm，微遇阻力時(shí)停止，將線栓阻斷在大腦中動(dòng)脈起始處，加固結(jié)扎頸外動(dòng)脈，防止線栓滑脫，縫合皮膚，阻斷血流2 h；在麻醉狀態(tài)下輕拉線栓，使其頭端回到頸外動(dòng)脈內(nèi)，實(shí)現(xiàn)再灌注。對(duì)照組大鼠不結(jié)扎不插線，其余步驟同模型組。模型組大鼠術(shù)后24 h采用神經(jīng)功能評(píng)分法[4]進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)價(jià)，評(píng)分1～3分者納入研究，評(píng)分0分和4分者予以剔除。對(duì)照組大鼠無(wú)死亡。模型組大鼠死亡7只，神經(jīng)功能評(píng)分0分者2只，4分者1只，均予以剔除，納入研究70只。對(duì)照組和模型組各取10只大鼠用于TTC染色。模型組剩余60只大鼠根據(jù)隨機(jī)數(shù)字法分為模型1 d組、模型3 d組和模型7 d組，每組20只，分別于術(shù)后1、3和7 d處死。

1.3 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分評(píng)估大鼠神經(jīng)行為術(shù)后24 h進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分：無(wú)神經(jīng)缺損癥狀為0分；缺血對(duì)側(cè)前肢不能完全伸展為1分；行走時(shí)向缺血對(duì)側(cè)轉(zhuǎn)圈為2分；行走時(shí)向缺血對(duì)側(cè)傾倒為3分；意識(shí)受到抑制、不能行走為4分；死亡為5分。評(píng)分1～3分為建模成功。

1.4 標(biāo)本采集和處理神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分后，對(duì)照組和模型組各取10只大鼠，過(guò)量麻醉處死大鼠，迅速斷頭取腦，用于TTC染色。對(duì)照組、模型1 d組、模型3 d組和模型7 d組各取10只大鼠，深度麻醉后，經(jīng)心臟注射生理鹽水，然后注射多聚甲醛，至大鼠全身僵硬，四肢微顫，取出大腦，置多聚甲醛中固定，經(jīng)石蠟包埋后，進(jìn)行冠狀切片，切片厚4 μm，用于HE染色、免疫組織化學(xué)染色和免疫熒光染色。對(duì)照組、模型1 d組、模型3 d組和模型7 d組各取剩余10只大鼠，深度麻醉后，冰上斷頭取腦，投入液氮中冷凍，用于RT-PCR法檢測(cè)。

1.5 大鼠腦組織TTC染色觀察腦梗死情況將新鮮腦組織冰凍30 min，切成厚2 mm切片，置于TTC中孵育15 min，每5 min翻動(dòng)1次切片，染成紅色者為正常腦組織，染成白色者為梗死組織，染色后將腦組織切片置于多聚甲醛中過(guò)夜浸泡，采用Image J軟件測(cè)定腦組織梗死面積，計(jì)算腦梗死體積。

1.6 HE染色觀察大鼠腦組織病理形態(tài)表現(xiàn)將大鼠腦組織切片室溫下風(fēng)干。蘇木素染色60 s，自來(lái)水沖洗10 s，鹽酸乙醇處理2 s，自來(lái)水沖洗2 s，氨水返藍(lán)10 s，自來(lái)水沖洗15 s，脫水、透明、封片后顯微鏡下觀察腦組織中神經(jīng)細(xì)胞壞死及血管水腫等情況。

1.7 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)大鼠腦組織中IGFBP-3和VEGF蛋白表達(dá)水平取腦組織切片晾干，過(guò)氧化氫孵育10 min，檸檬酸水微波爐中加熱10 min，加入TritonX-100孵育30 min，加入一抗：兔抗鼠IGFBP-3多克隆抗體(1∶200)、兔抗鼠VEGF多克隆抗體(1∶200)，過(guò)夜孵育，空白對(duì)照組以PBS代替一抗，加入二抗(1∶500)孵育30 min，DAB顯色，常規(guī)復(fù)染、脫水、封片。顯微鏡下觀察：細(xì)胞漿出現(xiàn)棕黃色為IGFBP-3、VEGF陽(yáng)性細(xì)胞，采用IPP 6.0軟件檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞的積分光密度(IOD)值，以IOD值代表目的蛋白表達(dá)水平。

1.8 RT-PCR法檢測(cè)大鼠腦組織中IGFBP-3和VEGF mRNA表達(dá)水平取100 g大鼠腦組織勻漿，加入TRIzol和氯仿提取腦組織中RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，對(duì)cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件：94℃、2 min；94℃、30 s，56℃、30 s，72℃、2 min，共38個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計(jì)算IGFBP-3和VEGF mRNA表達(dá)水平。引物序列見(jiàn)表1。

1.9 免疫熒光染色檢測(cè)大鼠腦組織中缺血半暗區(qū)微血管密度取大鼠腦組織切片，PBS清洗，PBST破膜20 min，加入BSA封閉1 h，加入一抗兔抗鼠CD31多克隆抗體(1∶200)過(guò)夜孵育，PBS清洗，加入熒光二抗(1∶500)孵育2 h，PBS清洗；加入一抗兔抗鼠α-SMA多克隆抗體(1∶200)過(guò)夜孵育，PBS清洗，加入熒光二抗(1∶500)孵育2 h。采用Image-Pro Plus軟件對(duì)圖像進(jìn)行處理。

表1 RT-PCR引物序列

2 結(jié) 果

2.1 2組大鼠行為表現(xiàn)和神經(jīng)行為評(píng)分對(duì)照組大鼠無(wú)神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)；模型組大鼠出現(xiàn)進(jìn)食少、活動(dòng)少和反應(yīng)遲鈍等表現(xiàn)及對(duì)側(cè)前肢屈曲、向外側(cè)轉(zhuǎn)圈、同側(cè)霍納征、行走時(shí)向?qū)?cè)傾倒等偏癱體征。對(duì)照組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分0分，模型組大鼠24 h神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分(1.86±0.73)分。

2.2 2組大鼠腦組織TTC染色對(duì)照組大鼠腦組織紅染，無(wú)白色梗死灶出現(xiàn)。24 h后模型組大鼠腦組織均出現(xiàn)白色梗死灶，腦組織水腫明顯，梗死灶主要位于紋狀體和皮層區(qū)，腦梗死體積為(28.34±3.57)%。見(jiàn)圖1(插頁(yè)四)。

2.3 各組大鼠腦組織病理形態(tài)表現(xiàn)對(duì)照組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞、毛細(xì)血管形態(tài)均正常，結(jié)構(gòu)完整，胞漿無(wú)紅染，結(jié)構(gòu)完整，無(wú)神經(jīng)細(xì)胞變性壞死。模型1 d組大鼠腦組織缺血區(qū)神經(jīng)細(xì)胞腫脹、結(jié)構(gòu)模糊、間質(zhì)水腫，出現(xiàn)細(xì)胞皺縮、核深染，毛細(xì)血管出現(xiàn)輕度水腫；模型3 d組大鼠腦組織缺血區(qū)神經(jīng)細(xì)胞皺縮，細(xì)胞和細(xì)胞間質(zhì)明顯水腫，組織間隙增寬，出現(xiàn)明顯空泡化，毛細(xì)血管中度水腫；模型7 d組大鼠腦組織缺血區(qū)神經(jīng)細(xì)胞壞死，細(xì)胞和細(xì)胞間質(zhì)水腫減輕，血管水腫減輕。見(jiàn)圖2(插頁(yè)五)。

2.4 各組大鼠腦組織中IGFBP-3和VEGF免疫組織化學(xué)染色結(jié)果及蛋白表達(dá)水平對(duì)照組大鼠腦組織見(jiàn)少量IGFBP-3弱陽(yáng)性細(xì)胞和少量VEGF陽(yáng)性細(xì)胞。不同時(shí)間模型組大鼠腦組織中均有IGFBP-3和VEGF陽(yáng)性表達(dá)，模型3 d組大鼠腦組織中IGFBP-3和VEGF陽(yáng)性表達(dá)最強(qiáng)，模型7 d組大鼠腦組織中IGFBP-3和VEGF陽(yáng)性表達(dá)減弱。見(jiàn)圖3(插頁(yè)五)和圖4(插頁(yè)五)。與對(duì)照組比較，不同時(shí)間模型組大鼠腦組織中IGFBP-3和VEGF 蛋白表達(dá)水平均明顯升高(P<0.01)；模型3 d組大鼠腦組織中IGFBP-3和VEGF 蛋白表達(dá)水平最高，模型7 d組大鼠腦組織中IGFBP-3和VEGF 蛋白表達(dá)水平較模型3 d組有所降低。見(jiàn)表2。

2.5 各組大鼠腦組織中IGFBP-3和VEGF mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組比較，不同時(shí)間模型組大鼠腦組織中IGFBP-3和VEGF mRNA表達(dá)水平均明顯升高(P<0.05)，模型3 d組大鼠腦組織中IGFBP-3和VEGF mRNA表達(dá)水平最高，模型7 d組大鼠腦組織中IGFBP-3和VEGF mRNA表達(dá)水平較模型3 d組有所降低。見(jiàn)表3。

表2 各組大鼠腦組織中IGFBP-3和VEGF 蛋白表達(dá)水平

表3 各組大鼠腦組織中IGFBP-3和VEGF mRNA表達(dá)水平

2.6 各組大鼠腦組織缺血半暗區(qū)微血管密度選擇CD31和α-SMA分別作為內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞標(biāo)記物，對(duì)腦缺血半暗區(qū)進(jìn)行免疫熒光染色，觀察微血管密度。與對(duì)照組比較，不同時(shí)間模型組大鼠腦組織缺血半暗區(qū)微血管密度均升高(P<0.01)，模型3 d組大鼠腦組織缺血半暗區(qū)微血管密度最高，模型7 d組大鼠腦組織缺血半暗區(qū)微血管密度較模型3 d組有所降低。見(jiàn)圖5(插頁(yè)五)和表4。

表4 各組大鼠腦組織中缺血半暗區(qū)微血管密度

2.7 大鼠腦組織中IGFBP-3 mRNA表達(dá)水平與VEGF mRNA表達(dá)水平和微血管密度的相關(guān)性分析大鼠腦組織中IGFBP-3 mRNA表達(dá)水平與VEGF mRNA表達(dá)水平和微血管密度均呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.563，P<0.05；r=0.612，P<0.05)。

3 討 論

胰島素樣生長(zhǎng)因子(insulin like growth factor，IGF)信號(hào)系統(tǒng)在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、遷移和血管生成等方面均發(fā)揮重要作用。IGF信號(hào)系統(tǒng)由IGF配體、IGF受體和IGFBPs組成，IGFBPs包括IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5和IGFBP-6，IGFBPs與IGF具有較高的親和力，在IGF生物活性調(diào)控中發(fā)揮重要作用[5]。在上述6種結(jié)合蛋白中，IGFBP-3與惡性腫瘤關(guān)系密切，因此成為研究的熱點(diǎn)[6]。IGFBP-3在多種惡性腫瘤中表達(dá)異常，具有抗腫瘤作用[7]。IGFBP-3在缺血再灌注損傷中表達(dá)也存在異常，如大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注后IGFBP-3表達(dá)先升高后降低[8]，IGFBP-3可能為缺血狀態(tài)下的一種生理反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示：腦梗死大鼠神經(jīng)功能評(píng)分升高，并出現(xiàn)腦梗死灶，表明腦梗死模型建立成功；HE染色結(jié)果顯示：大鼠腦梗死3 d時(shí)腦損傷最嚴(yán)重，腦梗死7 d時(shí)有所恢復(fù)；大鼠腦組織中IGFBP-3蛋白和mRNA表達(dá)水平在腦梗死3 d時(shí)最高，腦梗死7 d時(shí)有所降低，表明IGFBP-3可能參與腦梗死的缺血再灌注過(guò)程。

急性腦梗死后缺血核心區(qū)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生變性壞死，出現(xiàn)神經(jīng)功能不可逆性損傷，而梗死早期周圍缺血半暗區(qū)神經(jīng)細(xì)胞可存活一定時(shí)間，因此盡快建立側(cè)支循環(huán)、改善梗死灶周圍缺血半暗區(qū)供血和挽救瀕死神經(jīng)細(xì)胞對(duì)減輕腦梗死損傷和改善預(yù)后具有重要價(jià)值。腦梗死后血管新生受多種細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞分子和黏附因子等影響[9-10]。IGFBP-3和血管形成的關(guān)系也比較密切，IGFBP-3在不同疾病中對(duì)血管形成的作用不同，具有抑制血管形成和促進(jìn)血管形成的雙重作用。如IGFBP-3是人血清中一種主要的IGF結(jié)合蛋白，通過(guò)IGF依賴性和IGF非依賴性機(jī)制方式調(diào)節(jié)人頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成活性，其可通過(guò)阻斷整合素介導(dǎo)的腫瘤和血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附活性進(jìn)而抑制血管生成和惡性腫瘤的發(fā)展[11]；在胰腺癌細(xì)胞中上調(diào)IGFBP-3水平具有抗腫瘤血管形成的作用[12]；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者血清IGFBP-3水平升高，IGF-I和IGFBP-3在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病中發(fā)揮誘導(dǎo)血管生成的作用[13]；ANGUIANO-HERNANDEZ等[14]研究發(fā)現(xiàn)：IGFBP-3水平升高與血管生成增加有關(guān)。

本文作者對(duì)腦梗死大鼠腦組織中IGFBP-3 mRNA表達(dá)水平與血管形成的關(guān)系進(jìn)行研究，采用CD31/αSMA共同標(biāo)志微血管密度，結(jié)果顯示：腦梗死大鼠腦組織中微血管密度升高，腦組織中IGFBP-3 mRNA表達(dá)水平與VEGF mRNA表達(dá)水平和微血管密度呈正相關(guān)關(guān)系，表明IGFBP-3可能通過(guò)促進(jìn)血管形成參與腦梗死后缺血再灌注損傷過(guò)程。VEGF與血管發(fā)生和生長(zhǎng)關(guān)系密切，是一種特異性內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂原，可誘導(dǎo)血管生成、促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)和增加血管通透性[15]。VEGF促進(jìn)血管生成的作用：誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)相應(yīng)配體和受體[16]；促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移；增加血管細(xì)胞黏附分子和細(xì)胞間黏附分子水平；促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá)整合素受體；增加絲氨酸蛋白酶活性，降解細(xì)胞外基質(zhì)，從而促進(jìn)血管生成[17-18]。IGFBP-3在多種疾病中與VEGF關(guān)系密切，可與VEGF共同參與多種疾病的發(fā)病過(guò)程[19-21]，如下調(diào)VEGF后可抑制小鼠子宮IGFBP-3表達(dá)[22]。本研究結(jié)果顯示：腦梗死大鼠腦組織中IGFBP-3 mRNA表達(dá)水平與VEGF mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)關(guān)系，表明IGFBP-3可能通過(guò)與VEGF相互作用，促進(jìn)VEGF表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)新生血管生成。

綜上所述，腦梗死大鼠腦組織中IGFBP-3表達(dá)水平升高，其變化趨勢(shì)與腦組織中VEGF和微血管密度一致，IGFBP-3可能在腦梗死后新生血管形成中發(fā)揮重要作用。