王 治，洪 莉，李素廷，曾婉玲

(武漢大學人民醫(yī)院婦產科，湖北 武漢 430060)

子宮內膜癌(endometrial carcinoma ,EC)是婦科常見的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一[1]，占女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤20%～30%，好發(fā)于圍絕經期及絕經后女性。研究[2]顯示:EC每年發(fā)病率約為0.2/10 000～1/10 000，且近年來其發(fā)病率逐漸升高，并呈現年輕化趨勢。EC發(fā)病原因和機制尚不明確，其早期診斷及治療方面盡管已有較大進展，但仍有相當一部分的病例發(fā)展至晚期才被確診。因此，研究EC發(fā)病原因和疾病發(fā)展相關機制及干預靶標，有助于進一步改善EC的診斷、治療和預后。 隨著基因芯片技術的發(fā)展以及生物信息學相關工具的完善，目前基因表達匯編(Gene Expression Omnibus， GEO)數據庫[3]提供了大量的基因表達譜相關數據，對其進行數據分析可以快速發(fā)現腫瘤組織中的差異表達基因，并可通過進一步分析尋找到影響疾病發(fā)生發(fā)展的分子靶標。在肺癌[4]、胃癌[5]、乳腺癌[6]、神經母細胞瘤[7]、腸癌[8]和卵巢癌[9]等多種腫瘤中，對GEO數據庫進行分析已經在多種腫瘤機制研究中得到了廣泛應用，該分析方法已經被證實切實有效。通過生物信息學技術篩選EC患者組織的差異表達基因(differentially expressed genes, DEGs)來發(fā)現潛在標志物，對EC的診斷和治療方案的確定具有重要意義。本研究通過對GEO數據庫中EC組織的基因表達數據集GSE3678和GSE17025進行聯合分析，篩選出具有高可信度的DEGs和重要的相關信號通路，構建了DEGs的蛋白質-蛋白質互作網絡(protein-protein interaction network，PPI)，并篩選出了關鍵基因作為分子靶標，以期通過DEGs和PPI的分析結果為EC的研究提供新思路。

1 資料與方法

1.1 基因芯片數據集信息通過GEO數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下載高通量測序數據集GSE63678和GSE17025, 2組基因芯片數據類型均為Expression profiling by array，種屬均為Homo sapiens；GSE63678數據集注釋平臺為GPL571，包括5例正常組織樣本(GSM1555092～GSM1555096)和7例EC樣本(GSM1555085～GSM1555091)；GSE17025數據集注釋平臺為GPL570，包括12例正常組織樣本(GSM425927～GSM425938)和79例EC樣本(GSM425837～GSM425915)。

1.2 DEGs的提取和分析GEO2R(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)可用于分析GEO數據集中不同數據組的差異表達水平。在基因表達數據集中，以正常組織樣本為對照組，以EC組織為實驗組，使用GEO2R在線分析工具分別分析并篩選出GSE63678和GSE17025的DEGs，篩選標準為P<0.05并且|log(FC)|>2，使用R軟件ggplot2和pheatmap程序包分析DEGs并進行可視化，分別生成火山圖與熱圖。最后用FunRich軟件生成venn圖篩選出在GSE63678和GSE17025中同時上調或下調的DEGs用于進一步分析。

由于石墨烯材料的邊緣具有化學活性，Tan等[17]采用電子束光刻法和氧等離子體法將石墨烯圖形化成四列納米帶(GNRs)來改善羥基組的數量，每條納米帶的寬度為 (99.1±1.5) nm，長度為 5.5 μm。石墨烯圖形化前的光學圖像如圖3(a)所示；圖形化后的光學圖像如圖3(b)左圖所示，對應的AFM圖像如圖3(b)右圖所示。研究表明，圖形化后的石墨烯器件對pH的靈敏度(pH 6～8)由 6.5 mV/pH提升至 23.6 mV/pH。

1.3 基因本體論(gene ontology，GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路分析對大規(guī)?；蜻M行GO分析已經成為生物信息學分析的常用手段，可從細胞組分、生物過程和分子功能等多方面對DEGs進行全面注釋。KEGG數據庫已被廣泛用于通路富集分析，可得到EC發(fā)展過程中的關鍵通路。使用R語言clusterProfiler包對DEGs分別進行GO富集分析和KEGG信號通路分析，并對結果進行可視化。

2.4 PPI網絡關鍵模塊分析使用MCODE插件對PPI進行關鍵模塊的篩選，共篩選出3個重要的子模塊，篩選標準為K-core=2，Node Score Cutoff=0.2，Degree Cutoff=2，Maximum Depth=100。A模塊MCODE得分為42.048，由43個節(jié)點和883個相互作用關系構成(圖4A)；B模塊MCODE得分為4.25，由9個節(jié)點和17個相互作用關系構成(圖4B)；C模塊MCODE得分為4.0，由4個節(jié)點和6個相互作用關系構成(圖4C)。

EC是臨床常見的婦科腫瘤之一，在全球婦科腫瘤中發(fā)病率位列第4位，在過去數十年間其發(fā)病率和死亡率逐年升高。EC典型的臨床表現為陰道出血，肥胖、高血壓和糖尿病是EC的“三聯征”。目前EC治療以手術為主，同時給予化療或內分泌治療，但其治療效果卻不甚理想，存在手術不徹底、化療藥物毒性大和易產生耐藥性等問題[10-11]。發(fā)現較早的Ⅰ期EC患者綜合治療后5年生存率可達85%以上，中晚期患者生存率則明顯降低，Ⅱ期EC患 者5年生存率約為70%，Ⅲ期患者則僅為50%[12]。早期發(fā)現和治療是提高EC患者生存率的最佳途徑。隨著對EC發(fā)生發(fā)展機制的不斷探索，已有多項研究[13-15]證實：多基因組學改變和信號轉導通路的異常在EC發(fā)病中起重要的調控作用，多基因多通路的復雜連鎖反應過程也是腫瘤發(fā)生機制研究的難點和重點。

2 結 果

2.3 DEGs的PPI網絡構建基于String數據庫在線分析DEGs的PPI關系，納入PPI標準為綜合得分>0.4，共得到165個PPI節(jié)點和1 131個蛋白互作關系，在所有DEGs中占比80.1%。使用Cytoscape軟件對PPI網絡進行可視化及分析(圖3A)。使用CentiScape插件對PPI節(jié)點進行評估，選擇具有最高度連通性的10個節(jié)點DEG作為EC的關鍵基因(圖3B)，可能在EC發(fā)生發(fā)展中起到關鍵作用的基因有細胞分裂周期基因20(cell division cycle gene 20,CDC20)、極光激酶A(aurora kinase A,AURKA)、細胞周期蛋白B1(Cyclin B1,CCNB1)、泛素E3連接酶(denticleless E3 ubiquitin protein ligase,DTL)、中心體相關蛋白55(centrosomal protein 55,CEP55)、細胞周期蛋白依賴性激酶1(Cyclin-dependent kinase 1,CDK1)、驅動蛋白家族成員11(kinesin family member 11,KIF11)、母系胚胎亮氨酸拉鏈激酶(maternal embryonic leucine zipper kinase,MELK)、細胞周期蛋白B2(Cyclin B2,CCNB2)和苯并咪唑出芽抑制解除同源物蛋白1 (budding uninhibited by benzimidazoles 1, BUB1)。見表1。

2.2 對選用的復合（混）肥或作物專用肥，不含有機質或含量在15%以下的肥料，要增加充分腐熟的畜禽純干糞不少于20公斤/畝，可有效的杜絕或緩解玉米苗期肥害。

2.1 DEGs的提取對GSE63678數據集進行處理分析后，共鑒定出459個DEGs，其中包括242個上調基因(52.7%)和217個下調基因(47.3%)(圖1A，見插頁七)；GSE17025數據集分析，與對照組比較，EC組共有1 508個DEGs，有797個基因發(fā)生了上調(52.9%)，711個基因發(fā)生了下調(47.1%)(圖1B，見插頁七)。2組芯片數據集的差異基因表達熱圖分別見圖1C和1D(插頁七)。將篩選出來的差異表達基因進行Venny分析，結果顯示：在數據集GSE3678和GSE17025中同時發(fā)生上調的基因有100個，同時發(fā)生下調的基因有106個(圖1E，見插頁七)。

表1 關鍵基因的計算結果

1.4 PPI網絡構建和分析String在線數據庫(http://string.embl.de/)可用于檢索分子間相互作用以及預測蛋白質互作關系。使用String數據庫對上述所得的206個DEGs進行分析，構建PPI網絡并使用Cytoscape軟件進行可視化，使用Cytohubba插件對PPI網絡上所有DEGs進行評分，以其中最高相關度的前10個DEGs作為EC發(fā)病相關的關鍵基因，即hub基因。最后使用Cytoscape軟件MCODE插件對DEGs進行聚類功能模塊構建，關鍵模塊篩選標準為MCODE評分>4，并對關鍵模塊所包含基因進行GO富集分析和KEGG通路富集分析。模塊篩選標準：Degree Cutoff = 2， K-core = 2， Maximum Depth=100，Node Score Cutoff = 0.2。

A:Interaction of submodule A; B:Interaction of submodule B; C:Interaction of submodule C.

2.5 重要模塊基因的富集分析對PPI中3個重要子模塊所包含的56個DEGs進行GO富集分析和KEGG信號通路分析。GO富集分析結果顯示：DEGs主要在細胞核分裂和細胞周期調節(jié)等生物過程中發(fā)揮重要作用。KEGG信號通路分析結果顯示：DEGs主要與細胞周期、卵母細胞分裂、p53、細胞衰老、2型糖尿病和叉頭轉錄因子O(FoxO)等信號通路有密切關聯。見圖5(插頁七)。

3 討 論

從圖4中可以明顯看出，隨著毛雞只重的不斷增加，肉雞主產品出成在不斷增加。毛雞重量自4.31×500g增加到5.91×500g的過程中，主產品出成增加了0.09%，即：一只4.31×500g的毛雞要比一只5.91×500g的毛雞少出0.61kg主產品。

2.2 DEGs的GO富集分析和KEGG信號通路分析對共同上調或下調的DEGs進行GO富集分析，GO注釋主要分為細胞組成、生物過程和分子功能3個部分。DEGs主要富集在有絲分裂染色體分離、核分裂和細胞器分裂等生物學過程。KEGG信號通路分析結果顯示：差異基因主要富集于細胞周期、miRNA、p53信號通路和2型糖尿病等信號通路過程。見圖2(插頁七)。

隨著生物信息學技術及二代測序技術的飛速發(fā)展，通過基因芯片數據研究EC發(fā)病機制成為了可能，也是研究EC的重要方向。本研究通過生物信息學技術對GEO數據庫中2個EC相關數據集GSE63678和GSE17025進行聯合分析，共鑒定出了共同發(fā)生上調的差異基因100個，同時發(fā)生下調的差異基因106個；GO富集分析表明：差異基因主要富集于有絲分裂染色體分離、核分裂、細胞器分裂等生物學過程；KEGG信號通路分析表明：差異基因主要富集于細胞周期、miRNA、p53信號通路和2型糖尿病等信號通路過程。對差異基因構建的PPI網絡進行進一步分析后，CDC20、AURKA、CCNB1、DTL、CEP55、CDK1、KIF11、MELK、CCNB2和BUB1被篩選為關鍵基因，其在EC發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮重要作用。本文作者在PPI網絡中提取出了3個重要的子模塊，其所包含基因依然富集于細胞核分裂和細胞周期調節(jié)等生物過程，KEGG通路富集分析則表示這些基因主要與細胞周期、卵母細胞分裂、p53信號通路、細胞衰老、Ⅱ型糖尿病和FoxO信號通路等有關聯。

CDC20在許多種腫瘤中具有高表達，對腫瘤的發(fā)生起促進作用，抑制CDC20活性可加速細胞凋亡、調節(jié)細胞分裂周期[16-17]，因此CDC20可作為抗腫瘤治療的有效靶點。AURKA是一個周期性蛋白，通過參與中心體的復制分離和成熟在細胞周期中起著重要作用，其高表達可使多種抑癌蛋白失活同時激活多種致癌基因的表達[18]。CCNB1和CCNB2均屬于細胞周期蛋白(Cyclin)家族成員，研究[3,19-23]表明：CCNB1基因在乳腺癌、卵巢癌和直腸癌等多種腫瘤組織中同樣高表達，在結直腸癌和肺癌組織中CCNB2高表達能加快細胞周期進程、促進細胞異常增殖。未來有望通過靶向CCNB1和CCNB2基因的治療方法來抑制腫瘤細胞增殖。DTL介導細胞泛素化修飾及降解，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關聯，研究[24]表明：DTL通過介導雌激素促進EC細胞侵襲遷移和上皮-間質轉換，其機制可能為EC診斷及治療提供新思路。CEP55是中心體相關蛋白家族成員，在中心體依賴相關的細胞功能如細胞周期進展、胞質分裂中心體復制等過程中發(fā)揮重要作用[25]。CDK1可與細胞周期蛋白B(Cyclin B，CCNB)組成復合物即有絲分裂促進因子(mitosis-promoting factor，MPF)，促使細胞周期從G2期進入M期，是哺乳動物細胞增殖所必需的基因，CDK1活性失調會導致染色體破裂和細胞死亡[26]。KIF11是一種經典的分子馬達，在染色體的分離和雙極紡錘體的組裝過程中發(fā)揮重要作用，與細胞增殖有密切關聯[27]。MELK是一種周期依賴性激酶，研究[28-29]顯示：MELK在多種腫瘤細胞中高表達，并與腫瘤侵襲和轉移有密切關聯。BUB1是紡錘體的重要組成部分，其主要功能是監(jiān)控并保證有絲分裂過程的進行[30]。

式中，dij 是i和j之間的距離，Rj是i搜索區(qū)(dij

高度有序的細胞周期活動是細胞維持正常代謝與增殖過程的保證，當細胞周期[31]調控發(fā)生異常，例如周期相關蛋白、復合蛋白或細胞周期監(jiān)測點等細胞周期調控網絡發(fā)生異常時，會導致細胞增殖失控，含有異常受損DNA的細胞無法凋亡，最終導致細胞無限增殖和腫瘤形成[32]。本研究基于微陣列數據集，通過生物信息學技術分析了EC發(fā)生發(fā)展相關的易感基因和調控網絡，富集分析和PPI網絡分析表明：細胞周期相關的基因和通路在EC發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，PPI網絡中篩選出的關鍵基因絕大多數與細胞周期調控有關聯，由此可見，細胞周期失調是EC發(fā)病的主要機制。本研究結果為EC相關的發(fā)病機制、診斷、治療和預后判斷等研究提供了重要依據。結合進一步實驗驗證，以上參與EC發(fā)病的關鍵分子有望成為具有臨床價值的EC生物標志物和治療靶標。