張 利，葛 亮，張?zhí)m芳，馬小力，孫林春

（1.江蘇省中醫(yī)藥研究院 南京中醫(yī)藥大學附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院檢驗科，江蘇 南京 210009；2.南京醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院兒科研究所，江蘇 南京 210008）

人白細胞抗原B27（human leukocyte antigen-B27，HLA-B27）與成人強直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）密切相關(guān)，甚至直接參與了AS的發(fā)病。BREWERTON等[1]的研究結(jié)果顯示，HLA-B27與AS之間有很強的遺傳相關(guān)性，AS患者中HLA-B27的陽性率可達90%。此外，HLA-B27在其他脊椎關(guān)節(jié)病，如反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎[2]、銀屑病關(guān)節(jié)炎[3]等患者中的陽性率也高于正常人。因此，HLA-B27對脊柱關(guān)節(jié)病的診斷和鑒別診斷有重要的參考價值。流式細胞術(shù)是目前檢測外周血淋巴細胞HLA-B27表達的主要方法，但尚缺乏統(tǒng)一的參考區(qū)間，各臨床實驗室多采用試劑廠家提供的參考區(qū)間，也有一些臨床實驗室自行建立參考區(qū)間，但這些參考區(qū)間均只針對成年人群，尚未見兒童HLA-B27參考區(qū)間的報道[4]。風濕免疫學專家大多認為幼年起病的慢性關(guān)節(jié)炎是一種異質(zhì)性疾病，以往這類疾病分類無統(tǒng)一標準，尤其是脊柱關(guān)節(jié)疾病的命名更為混亂。國際風濕病學會聯(lián)盟（the International League of Associations for Rheumatology，ILAR）于2004年正式發(fā)布了幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎（juvenile idiopathic arthritis，JIA）的定義：16歲以下兒童持續(xù)6周以上，且排除其他疾病的不明原因關(guān)節(jié)腫脹，稱為幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎[5]。ILAR發(fā)布的相關(guān)標準中將JIA分為7個亞型，將以往概念中的幼年強直性脊柱炎歸入JIA的附著點炎癥相關(guān)型（enthesitis related arthritis，ERA）。目前，大多研究認為7個JIA亞型中，只有ERA與HLA-B27密切相關(guān)，ERA患兒成年后大多進展為AS[6]。近年來，HLA-B27對兒童ERA的輔助診斷作用逐漸得到臨床的認可和重視。然而，兒童由于免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完全，HLA-B27的參考區(qū)間較成人可能存在較大差異，建立兒童HLA-B27的參考區(qū)間對于指導臨床診療至關(guān)重要。為此，本研究擬建立南京地區(qū)表觀健康兒童HLA-B27的參考區(qū)間，并將其與廠商提供的參考區(qū)間作比較，探討二者之間的差異，以期為臨床診療提供參考。

1 材料和方法

1.1 研究對象

1.1.1 參考區(qū)間建立人群 選取2015—2018年在南京醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院因病就診或進行健康體檢的兒童460例，其中男255例、女205例，年齡2～16歲，其中<3歲19例、3～<6歲95例、6～<12歲248例、≥12歲98例。根據(jù)臨床診斷，460例兒童中上呼吸道感染251例、腹瀉88例、下呼吸道感染72例、先天性心臟病25例、腺樣體肥大24例。所有兒童均無ERA自覺癥狀，體格檢查示無脊柱、外周關(guān)節(jié)、關(guān)節(jié)周圍組織炎癥或其他病變，且相關(guān)實驗室指標無異常，排除可能對會對HLA-B27檢測結(jié)果造成影響的疾病。

1.1.2 參考區(qū)間驗證人群 選取2018年1—12月在南京醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院行健康體檢的表觀健康兒童200名，其中男121名、女79名，年齡5～14歲，均無ERA自覺癥狀，體格檢查示無脊柱、外周關(guān)節(jié)、關(guān)節(jié)周圍組織炎癥或其他病變，實驗室常規(guī)檢測項目均無異常。另選取同期南京醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院依據(jù)ILAR相關(guān)標準確診為ERA的患兒50例，其中男27例、女23例，年齡6～15歲。

1.2 儀器和試劑

FACSCantoⅡ流式細胞儀及配套HLA-B27試劑盒、溶血素購自美國BD公司。

1.3 方法

采用乙二胺四乙酸抗凝管采集所有對象清晨空腹靜脈血2 mL，顛倒混勻。取Falcon流式細胞管，加入100 μL外周血，再加入抗HLA-B27/抗CD4-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）抗體，渦旋儀震蕩混勻，室溫避光孵育15 min，加入1 mL 1×溶血素，混勻后室溫避光孵育15 min，加入2 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS），1 200×g離心5 min，棄上清，加入0.9% NaCl溶液200 μL重懸細胞，上機檢測，以CD3-藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）標記的T淋巴細胞設(shè)門，檢測門內(nèi)細胞HLA-B27表達的平均熒光強度。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。采用單樣本K-S檢驗進行正態(tài)性檢驗。呈偏態(tài)分布的數(shù)據(jù)以中位數(shù)（M）[百分位數(shù)（P2.5～P97.5）]表示，組間均數(shù)比較采用非參數(shù)Kruskal wallis檢驗。不同參考區(qū)間比較采用一致性檢驗，以kappa值判斷2個參考區(qū)間的一致性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 460例兒童HLA-B27檢測結(jié)果的分布

單樣本K-S檢驗結(jié)果顯示，460例兒童的HLA-B27平均熒光強度檢測結(jié)果呈偏態(tài)分布（Z=1.615，P=0.011），為100（78～121）。

2.2 兒童HLA-B27參考區(qū)間的建立

2.2.1 不同年齡兒童HLA-B27平均熒光強度的比較 不同年齡兒童HLA-B27平均熒光強度差異無統(tǒng)計學意義（χ2=3.438，P=0.329）。見表1。

表1 不同年齡兒童HLA-B27平均熒光強度的比較 M（P2.5～P97.5）

2.2.2 不同性別兒童HLA-B27平均熒光強度的比較 不同性別兒童HLA-B27平均熒光強度差異無統(tǒng)計學意義（χ2=3.766，P=0.282）。

表2 不同性別兒童HLA-B27平均熒光強度 M（P2.5～P97.5）

2.2.3 兒童HLA-B27參考區(qū)間的建立 由于不同年齡和性別兒童HLA-B27檢測結(jié)果差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），且HLA-B27只在升高時才有臨床意義，因此合并數(shù)據(jù)后采用百分位數(shù)法建立單側(cè)97.5%的參考區(qū)間。本地區(qū)兒童HLA-B27的參考區(qū)間為<121。

2.3 本研究建立的參考區(qū)間與廠商參考區(qū)間的一致性比較

廠商提供的正常人外周血T淋巴細胞HLA-B27平均熒光強度的參考區(qū)間為0～147。對2個參考區(qū)間進行一致性比較，結(jié)果顯示一致性較差（kappa=0.013，P<0.001）。

2.4 新參考區(qū)間的驗證

根據(jù)廠商提供的參考區(qū)間，200名表觀健康兒童中有6名HLA-B27檢測結(jié)果為升高，異常率為3%；根據(jù)本研究建立的新參考區(qū)間，200名表觀健康兒童中有10名升高，異常率為5%；共有4名結(jié)果不一致，占總?cè)藬?shù)的2%。二者異常率差異無統(tǒng)計學意義（χ2=1.41，P>0.05）。

根據(jù)廠商提供的參考區(qū)間，50例ERA患兒中有13例HLA-B27陽性，陽性率為26%；根據(jù)本研究建立的新參考區(qū)間，50例ERA患兒中有39例HLA-B27陽性，陽性率為78%。二者陽性率差異有統(tǒng)計學意義（χ2=49.18，P<0.001）。

3 討論

流行病學調(diào)查結(jié)果顯示，AS患者HLA-B27陽性率可高達95%，而正常人群的HLA-B27陽性率在10%以下；HLA-B27攜帶者的AS相對發(fā)病風險為70%，HLA-B27陽性的AS患者其一級親屬發(fā)生AS的概率是正常家系的11倍，呈現(xiàn)出明顯的家族聚集性[7]。ASQUITH等[8]在轉(zhuǎn)入人類HLA-B27基因的大鼠中觀察到多種與人類AS相似的臨床表現(xiàn)，而攜帶HLA-B27基因數(shù)量少的大鼠則未出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎等AS表現(xiàn)。雖然AS的發(fā)病機制不明，但目前已經(jīng)公認HLA-B27與AS的發(fā)病相關(guān)。

ERA是兒童常見的慢性風濕性疾病之一，早期癥狀不典型，且未成年人的骨骼尚在發(fā)育，一些發(fā)育時期關(guān)節(jié)的正常表現(xiàn)，如骶骨骨骺、關(guān)節(jié)面的局限性凹陷、髂骨側(cè)關(guān)節(jié)面的囊樣改變也與ERA的病理特征相似[9]，這給臨床診斷增加了難度。近年來，HLA-B27在ERA的輔助診斷中逐漸得到臨床的認可和重視。然而，目前采用的HLA-B27參考區(qū)間多為成人參考區(qū)間，且由廠商提供。由于兒童有其特有的生長發(fā)育規(guī)律，與成人之間存在較大的生理差異，因此某些檢測項目的參考區(qū)間可能不適用于兒童。我們在實際工作發(fā)現(xiàn)，一些被診斷為ERA的患兒，其HLA-B27根據(jù)現(xiàn)有的參考區(qū)間被判斷為陰性，雖然HLA-B27陽性與ERA之間的符合率并非100%，但這也提示HLA-B27的表達情況在成人與兒童之間可能不完全一致。因此，有必要建立未成年人HLA-B27的參考區(qū)間。

本研究用于建立參考區(qū)間的兒童均無ERA自覺癥狀，無脊柱、外周關(guān)節(jié)、關(guān)節(jié)周圍組織炎癥或其他病變，臨床和實驗室檢查也無其他AS相關(guān)指標異常，所得結(jié)果能真實、可靠地反映兒童HLA-B27的表達情況。本研究結(jié)果顯示，460例兒童外周血T淋巴細胞HLA-B27平均熒光強度數(shù)據(jù)呈偏態(tài)分布，且不同年齡和性別兒童差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），因此合并數(shù)據(jù)后采用百分位數(shù)法建立單側(cè)97.5%的參考區(qū)間，結(jié)果為<121。建立的新參考區(qū)間與廠商提供的參考區(qū)間的一致性較差（kappa=0.013，P<0.001）。用2個一致性有顯著差異的參考區(qū)間分析同一個檢測結(jié)果時，很可能會出現(xiàn)完全不同的結(jié)論[10]。為此，本研究另選取200名表觀健康兒童對新參考區(qū)間進行驗證。結(jié)果顯示，根據(jù)新參考區(qū)間，200名表健康兒童HLA-B27的異常率為5%，50例ERA患兒的HLA-B27陽性率為78%；根據(jù)廠商提供的參考區(qū)間，200名表觀健康兒童HLA-B27的異常率為3%，50例ERA患兒的HLA-B27陽性率為26%；二者異常率差異無統(tǒng)計學意義（χ2=1.41，P>0.05），陽性率差異有統(tǒng)計學意義（χ2=49.18，P<0.001）。說明采用2種參考區(qū)間得出的HLA-B27特異性均較好，誤診率較低；但采用新參考區(qū)間得出的HLA-B27敏感性優(yōu)于廠商提供的參考區(qū)間，使用廠商提供的參考區(qū)間可能會造成一部分ERA患兒漏診。

雖然HLA-B27在所有有核細胞表面都表達，但其主要表達于淋巴細胞表面。未成年人的免疫系統(tǒng)尚在發(fā)育中，免疫細胞表面抗原可能未分化完全或未充分暴露，這可能導致未成年人淋巴細胞表面HLA-B27平均表達強度低于成人，因此使用成人參考區(qū)間可能會造成漏診。由于HLA-B27與兒童ERA高度相關(guān)，因此根據(jù)參考區(qū)間準確判斷HLA-B27陽性對于ERA的輔助診斷和鑒別診斷具有重要價值，尤其是對于依據(jù)現(xiàn)有臨床表現(xiàn)和影像學檢查仍難以作出明確判斷的患兒。此外，對有HLA-B27陽性家族史，根據(jù)參考區(qū)間判斷HLA-B27陽性但尚無ERA臨床癥狀或骨骼改變的兒童，臨床建議定期復查，早期發(fā)現(xiàn)，及時采取藥物控制、心理干預(yù)、行為干預(yù)和運動指導等綜合治療措施，對于成年后延緩疾病進展，提高生活質(zhì)量有重要作用。

綜上所述，本研究建立了南京地區(qū)兒童外周血HLA-B27的參考區(qū)間，依據(jù)該參考區(qū)間診斷ERA的特異性與廠商提供的參考區(qū)間無差異，但提高了診斷敏感性，降低了漏診率。