牛衛(wèi)東，許太彬，孫麗梅，安 戈，史 軍，李 羿，趙瑞臻

（鄭州市疾病預(yù)防控制中心，河南 鄭州 450007）

2019年12月，武漢市出現(xiàn)了由嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）引發(fā)的新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）[1]。SARS-CoV-2是一種β屬冠狀病毒，屬于單鏈RNA病毒，有包膜[2]，其 基因特征與嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome-related coronavirus，SARSr-CoV）和中東呼吸綜合征冠狀病毒（middle east respiratory syndrome-related coronavirus，MERSr-CoV）有明顯區(qū)別[3-4]。目前，實(shí)時熒光逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）仍是COVID-19疑似病例的主要確診方法[5]。實(shí)時熒光RT-PCR主要檢測SARS-CoV-2基因組中開放讀碼框1ab（open reading frame 1ab，ORF1ab）和核殼蛋白（nucleocapsid protein，N）[5]。在SARSCoV-2核酸檢測過程中會出現(xiàn)核酸單靶標(biāo)陽性的情況，雖然在最新版《新型冠狀病毒肺炎實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)指南》[5]中明確了SARS-CoV-2核酸單靶標(biāo)陽性的判定規(guī)則，但仍需對SARS-CoV-2核酸單靶標(biāo)陽性的情況進(jìn)行分析和探討。截至2020年3月11日，鄭州市疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室針對全市COVID-19疑似患者和密切接觸者共做了4 375次的SARS-CoV-2核酸檢測，其中有23例COVID-19疑似患者和密切接觸者首次檢測（以下簡稱首檢）出現(xiàn)了SARS-CoV-2核酸單靶標(biāo)陽性的情況，本研究擬對這23例標(biāo)本進(jìn)行跟蹤檢測，以期為實(shí)驗(yàn)室檢測提供參考。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本來源

收集2020年1月20日—3月11日，鄭州市COVID-19疑似患者、密切接觸者的鼻拭子或咽拭子標(biāo)本。所有標(biāo)本均嚴(yán)格按照《新型冠狀病毒肺炎防控方案》采集并轉(zhuǎn)運(yùn)至鄭州市疾病預(yù)防控制中心微生物檢驗(yàn)所病毒實(shí)驗(yàn)室。

1.2 試劑與儀器

病毒核酸提取試劑盒（EX-RNA/DNA病毒）和GeneRoteX 96全自動核酸提取儀均購自西安天隆科技有限公司。Heidolph-Multi Reax多位試管振蕩器購自德國海道夫公司。Parafilm封口膜購自美國BEMIS公司。采用實(shí)時熒光RTPCR檢測SARS-CoV-2，試劑盒購自上海伯杰醫(yī)療科技有限公司，檢測儀器為CFX96實(shí)時熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad公司）。

1.3 標(biāo)本的處理與檢測

將鼻拭子/咽拭子病毒采樣管用封口膜密封后，置于試管振蕩器上，振蕩10 min。按照SARS-CoV-2核酸提取試劑盒說明書要求完成核酸提取，吸取5 μL標(biāo)本，加入到20 μL分裝好的核酸檢測液中，將剩余標(biāo)本置于-20 ℃保存。

實(shí)時熒光RT-PCR反應(yīng)條件為：逆轉(zhuǎn)錄50 ℃10 min，預(yù)變性95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，55 ℃40 s，45個循環(huán)。ORF1ab基因檢測通道為FAM，N基因?yàn)镠EX/VIC，內(nèi)參基因?yàn)镽OX。

1.4 結(jié)果評價

1.4.1 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn) 在同一檢測中必須同時滿足：陽性對照3個通道擴(kuò)增循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct）均≤30，陰性對照均無Ct值，否則本次檢測無效。

1.4.2 結(jié)果判讀 若ROX通道Ct值>38，則判定標(biāo)本不合格。若ROX通道Ct值≤38，F(xiàn)AM通道、HEX/VIC通道均無Ct值，則判定為陰性。FAM通道、HEX/VIC通道Ct值≤38，則判定為陽性。FAM通道、HEX/VIC通道均有Ct值，且有Ct值>38，或僅有單個通道出現(xiàn)明顯擴(kuò)增曲線時，判定為不確定，建議復(fù)測。本研究以僅單個通道出現(xiàn)明顯擴(kuò)增曲線作為單靶標(biāo)陽性。對單靶標(biāo)陽性的標(biāo)本，重新采樣檢測間隔時間不少于24 h。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；如果<5的預(yù)期值>總數(shù)的1/5，且樣本數(shù)<40，則用Fisher精確概率法進(jìn)行比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 檢測概況

對23例首檢為SARS-CoV-2核酸單靶標(biāo)陽性者重新采樣檢測，其中有8例（34.78%）SARSCoV-2核酸為陽性，15例（65.22%）為陰性。見表1。

2.2 重新采樣檢測陽性率

在23例首檢為SARS-CoV-2核酸單靶標(biāo)陽性的標(biāo)本中，有6例為ORF1ab基因單靶標(biāo)陽性，占26.09%，其中有1例重新采樣檢測后被確認(rèn)為陽性，重新采樣檢測陽性率為16.67%；有17例為N基因單靶標(biāo)陽性，占73.91%，其中有7例重新采樣檢測后被確認(rèn)為陽性，重新采樣檢測陽性率為41.18%。2個基因之間重新采樣檢測陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.174，P>0.05）。見表2。

2.3 檢測次數(shù)

從整體來看，23例COVID-19疑似患者和密切接觸者中，有16例進(jìn)行了2次采樣檢測，6例進(jìn)行了3次采樣檢測，1例進(jìn)行了5次采樣檢測，方得到最終可判定的結(jié)果。從基因型別來看，6例ORF1ab基因單靶標(biāo)陽性者均進(jìn)行了2次采樣檢測，方得到最終可判定結(jié)果；17例N基因單靶標(biāo)陽性者中，10例進(jìn)行2次采樣檢測，6例進(jìn)行3次采樣檢測，1例進(jìn)行了5次采樣檢測，方得到最終可判定的結(jié)果。從最終確診情況來看，8例確認(rèn)為SARS -CoV-2核酸陽性的患者中，7例進(jìn)行了2次采樣檢測，1例進(jìn)行了3次采樣檢測；15例SARS-CoV-2核酸陰性者中，9例進(jìn)行了2次采樣檢測，5例進(jìn)行了3次采樣檢測，1例進(jìn)行了5次采樣檢測。如果按最新版檢測方案[5]判定，將會產(chǎn)生6例假陽性結(jié)果，6例均為N基因單靶標(biāo)陽性。見表2。

表1 23例SARS-CoV-2核酸單靶標(biāo)陽性者跟蹤檢測Ct值結(jié)果

2.4 Ct值分布

首檢單靶標(biāo)陽性標(biāo)本整體的C t值為36.00～36.99時出現(xiàn)高峰，首檢ORF1ab基因單靶標(biāo)陽性的Ct值集中分布于36.00～38.00。首檢單靶標(biāo)陽性轉(zhuǎn)陽標(biāo)本的Ct值分布比較分散。有1例Ct值為40.68的標(biāo)本在第2次檢測后被確認(rèn)為陽性。見圖1。

表2 得到最終可判定的結(jié)果所用檢測次數(shù) 例

圖1 SARS-CoV-2核酸單靶標(biāo)陽性標(biāo)本Ct值分布

3 討論

自2019年12月COVID-19疫情在武漢暴發(fā)以來，涌現(xiàn)出了各種針對SARS-CoV-2的檢測方法，但實(shí)時熒光RT-PCR仍是COVID-19的主要確診方法[5]。按照相關(guān)試劑盒說明書要求，單靶標(biāo)陽性標(biāo)本應(yīng)該判定為不確定。本研究對23例首檢單靶標(biāo)陽性標(biāo)本的跟蹤檢測結(jié)果顯示，有34.78%的單靶標(biāo)陽性標(biāo)本在跟蹤檢測中被確認(rèn)為陽性。提示單靶標(biāo)陽性標(biāo)本應(yīng)該進(jìn)行跟蹤檢測，以免造成假陰性結(jié)果，增加疫情擴(kuò)散風(fēng)險(xiǎn)。

COVID-19疫情突然暴發(fā)，臨床檢測需求增加，但很多檢測試劑的靈敏度、穩(wěn)定性和可靠性還有待進(jìn)一步驗(yàn)證[6]，有些試劑ORF1ab基因和N基因的檢測靈敏度之間有差異，可能會出現(xiàn)單靶標(biāo)陽性結(jié)果[7]。還有研究結(jié)果顯示，實(shí)時熒光定量PCR檢測N基因的靈敏度更高[8]。有研究結(jié)果顯示，COVID-19潛伏期長達(dá)14 d，在感染早期臨床表現(xiàn)不典型[9]，病毒復(fù)制數(shù)量達(dá)不到試劑盒檢測閾值時，可能會出現(xiàn)假陰性或單靶標(biāo)陽性[10]。

假陰性和單靶標(biāo)陽性結(jié)果的出現(xiàn)也可能與標(biāo)本采集質(zhì)量有關(guān)[10]，大量非呼吸專業(yè)醫(yī)護(hù)人員不熟悉鼻/咽拭子的采集規(guī)范，可能會造成采集部位不準(zhǔn)確[10]、采集手法不到位等情況，影響采集標(biāo)本的質(zhì)量。還有研究表明，痰液的檢出率明顯高于鼻/咽拭子，說明多種標(biāo)本同時采集可以提高新冠病毒檢出率[11]。

ORF1ab基因中序列同一性在SARS-CoV-2和乙型冠狀病毒其他成員之間<90%，是區(qū)分SARS-CoV-2與其他冠狀病毒的重要靶標(biāo)[4]，ORF1ab基因特異性強(qiáng)，因此23例單靶標(biāo)陽性標(biāo)本中，僅有6例為ORF1ab基因單靶標(biāo)陽性。

在冠狀病毒的結(jié)構(gòu)蛋白中，N蛋白是最保守和最穩(wěn)定的蛋白，因此N基因相對保守[4，12]，易與其他發(fā)生交叉反應(yīng)，因此一些試劑檢測N基因的靈敏度更高[8]。23例單靶陽性標(biāo)本中，73.91%為N基因單靶標(biāo)陽性，且有10例轉(zhuǎn)為陰性，可能是與其他病毒發(fā)生交叉反應(yīng)。N基因單靶標(biāo)陽性標(biāo)本中有7例轉(zhuǎn)為陽性，重新采樣檢測陽性率為41.18%。

從整體的檢測次數(shù)來看，絕大多數(shù)首檢單靶標(biāo)陽性者在連續(xù)2次跟蹤檢測后，就能夠得到明確結(jié)果，但仍有部分單靶標(biāo)陽性者需要檢測3～5次。多次檢測后，N基因仍出現(xiàn)單靶標(biāo)陽性者也可能是其他冠狀病毒感染[13]。按照《新型冠狀病毒肺炎實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)指南》中實(shí)驗(yàn)室確認(rèn)陽性標(biāo)本的標(biāo)準(zhǔn)，23例單靶標(biāo)陽性的標(biāo)本中將出現(xiàn)6例假陽性標(biāo)本，且6例假陽性標(biāo)本均為N基因單靶標(biāo)陽性，提示同種類型標(biāo)本2次采樣檢測中均出現(xiàn)單靶標(biāo)陽性的檢測結(jié)果時，應(yīng)該慎重對待，并重新采樣跟蹤檢測。

從重新采樣檢測陽性標(biāo)本的Ct值分布來看，有1例Ct值為40.68的首檢單靶標(biāo)陽性標(biāo)本在第2次檢測時被確認(rèn)為陽性，提示單靶標(biāo)陽性標(biāo)本的Ct值不論是高是低均應(yīng)重新采樣檢測。