余 琰 郭 玫*邵 晶 李 娟武權(quán)生

［1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅蘭州 730101； 2.甘肅省中藥質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730000；3.甘肅省高校中（藏） 藥化學(xué)與質(zhì)量研究省級重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730000］

六味調(diào)更片由黃芪、當(dāng)歸、女貞子等6 味藥材組成，方中黃芪功善補(bǔ)氣健脾，為君藥；當(dāng)歸補(bǔ)血活血，女貞子滋補(bǔ)肝腎，共為臣藥，諸藥協(xié)同，共奏補(bǔ)腎健脾、補(bǔ)氣養(yǎng)血的功效，臨床用于治療婦女圍絕經(jīng)期綜合征，療效確切可靠［1-3］，但其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中只有以HPLC 法測定阿魏酸、黃芪甲苷含有量，而且前者檢測采用二極管陣列檢測器，后者檢測采用蒸發(fā)光散射檢測器（二極管陣列檢測器對其干擾大），同時(shí)兩者流動相體系不同而不能同時(shí)測定，耗時(shí)費(fèi)力。為了提高六味調(diào)更片質(zhì)量以更好地應(yīng)用于臨床，本實(shí)驗(yàn)選擇君藥黃芪中黃芪甲苷、毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷，臣藥當(dāng)歸中阿魏酸，女貞子中特女貞苷作為指標(biāo)，并采用UPLCMS／MS 法同時(shí)測定四者含量，以期為更全面控制該制劑質(zhì)量提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 UPLC-MS／MS 儀 （液相型號LC-20ADXR，日本島津公司；質(zhì)譜型號TRIPLE QUAD 5500，美國AB Sciex 公司）；CAPCELL PAK C18 MGⅢ色譜柱（日本資生堂公司）；AE240 電子天平［十萬分之一，梅特勒-托利多儀器（上海） 有限公司］。

1.2 試劑與藥物 毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷（批號111920，純度≥97.6%）、阿魏酸 （批號110773，純度≥99%）、特女貞苷（批號111926，純度≥96.3%）、黃芪甲苷 （批號11078，純度≥96.9%） 對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈、甲醇為色譜純，均購自德國默克公司；其他試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果 參考文獻(xiàn)［4-8］報(bào)道。

2.1 UPLC 條件 CAPCELL PAK C18MGⅢ色譜柱（2.0 mm×150 mm，5 μm）；流動相0.1% 甲酸（A） -乙腈（B），梯度洗脫（0～2 min，5%～15%B；2～2.5 min，15%～30% B；2.5～3.5 min，30%～50% B；3.5～4 min，50%～70% B；4～8 min，70%～73% B；8～9 min，73%～75% B；9～10 min，75%～95%B；10～12 min，95%～98%B）；體積流量0.3 mL／min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 MS 條件 ESI 電噴霧離子源，正負(fù)離子同時(shí)監(jiān)測；電噴霧電壓5 500、-4 500 V；離子源溫度550 ℃；氣簾氣30 psi （1 psi ＝0.133 kPa）；碰撞氣6 psi；霧化氣40 psi；輔助氣45 psi。具體參數(shù)見表1，提取離子流色譜圖見圖1。

表1 各成分MS 參數(shù)Tab.1 MS parameters for various constituents

圖1 各成分提取離子流色譜圖Fig.1 Extraction ion current chromatograms of various constituents

2.3 溶液制備

2.3.1 供試品溶液 取片劑適量，研細(xì)后過65 目篩，取粉末約0.1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入25 mL 甲醇，密塞，稱定質(zhì)量，超聲（300 W、40 kHz） 處理1 h，放冷，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，0.22 μm 微孔濾膜濾過濾，取續(xù)濾液1 mL，甲醇定容至10 mL，即得。

2.3.2 對照品溶液 精密稱取各對照品適量，甲醇溶解并定容，得到貯備液（毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、特女貞苷、黃芪甲苷含量分別為0.197 2、0.203 8、0.192 9、0.209 8 mg／mL），取適量置于量瓶中，甲醇定容，即得（四者含有量分別為0.985 8、0.407 7、4.823 6、2.097 9 μg／mL），甲醇逐級稀釋成不同質(zhì)量濃度。

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.3.2”項(xiàng)下對照品溶液，在“2.1”“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積平均值為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸，結(jié)果見表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.3.2”項(xiàng)下對照品溶液，在“2.1”“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定6次，測得毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、特女貞苷、黃芪甲苷峰面積RSD 分別為0.74%、0.57%、1.6%、1.4%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批片劑6 份，按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定，測得毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、特女貞苷、黃芪甲苷含有量RSD 分別為1.02%、1.33%、1.18%、1.64%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一份供試品溶液，室溫下于0、2、4、6、8、10、12、24 h 在“2.1”“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定，測得毛蕊異黃酮-7-Oβ-D-葡萄糖苷、阿魏酸、特女貞苷、黃芪甲苷峰面積RSD 分別為1.19%、1.68%、1.32%、1.75%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取各成分含有量已知的同一批片劑粉末6 份，每份約0.05 g，精密稱定，精密加入對照品溶液適量，按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率。結(jié)果，毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、特女貞苷、黃芪甲苷平均加樣回收率分別為98.5%、101.5%、99.4%、98.4%，RSD 分別為2.1%、1.8%、1.1%、1.9%。

2.9 樣品含有量測定 取3 批片劑，按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算含有量。結(jié)果，毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、特女貞苷、黃芪甲苷平均含有量分別為12.23、43.25、208.67、71.69 μg／g。

3 討論

在樣品提?。?-12］時(shí)比較了加熱回流和超聲提取，發(fā)現(xiàn)后者可使成分提取完全，而且操作簡單。

本實(shí)驗(yàn)采用準(zhǔn)分子離子／子離子進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷形成的準(zhǔn)分子離子為［M＋H］＋，阿魏酸為［M＋H］＋，特女貞苷為［M-H］-，黃芪甲苷為［M＋Na］＋。子離子是準(zhǔn)分子離子經(jīng)過碰撞誘導(dǎo)解離產(chǎn)生的碎片離子，在碰撞池中中性分子（N2） 的碰撞把能量傳遞給準(zhǔn)分子離子，使其分子鍵斷裂，并與所選擇的離子重排形成子離子。由于黃芪甲苷形成的［M＋Na］＋性質(zhì)特殊，幾乎不可能得到穩(wěn)定的二級碎片離子，故未展示其子離子。再對比了正、負(fù)離子模式下各成分的信號響應(yīng)值，發(fā)現(xiàn)特女貞苷在負(fù)離子模式時(shí)信號響應(yīng)值高，而其余3 種成分在正離子模式時(shí)高，故僅對特女貞苷含有量測定采用負(fù)離子模式。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立UPLC-MS／MS 法同時(shí)測定六味調(diào)更片中毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、女貞苷、黃芪甲苷的含有量，該方法簡便、快速、準(zhǔn)確，靈敏度高，重復(fù)性好，可用于該制劑質(zhì)量控制，并為其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供支持。