姚方龍， 任 放， 徐紅艷， 姜 慧， 任吉華

（重慶醫(yī)科大學感染性疾病分子生物學教育部重點實驗室，重慶400016）

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是導(dǎo) 致急慢性肝炎的主要原因，并可逐步發(fā)展為肝硬化和肝癌，每年約有100 萬人死于HBV 相關(guān)的各種終末期疾病，HBV 感染已成為嚴重威脅人類健康的世界性衛(wèi)生難題［1-2］。目前，治療乙型肝炎現(xiàn)癥患者的主要藥物包括干擾素和核苷類似物。由于HBV 逆轉(zhuǎn)錄酶缺乏保真性，病毒在復(fù)制過程中容易發(fā)生突變，而這些突變可能會降低干擾素的療效，導(dǎo)致干擾素僅對不到30%的患者效果明顯［3］。而且干擾素副作用較大，應(yīng)用受到一定限制。核苷類似物長期用藥可能產(chǎn)生病毒耐藥問題［4-5］。因此要進一步改善乙肝現(xiàn)癥患者的治療效果，需要鑒定新型抗病毒作用因子。

HBV 感染及相關(guān)肝病普遍存在性別差異，流行病學表明男性血清中乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）陽性率及其滴度明顯高于女性［6］。HBV 攜帶者發(fā)病率是男性高于女性（10.7%vs4.4%）［7］，且男性 HBV 攜帶者的病毒載量也高于女性攜帶者［6］。慢性HBV 感染相關(guān)肝細胞癌的發(fā)病率也呈現(xiàn)出性別之間的分化，男女發(fā)病率之比大概在5∶1～7∶1［8］。有研究發(fā)現(xiàn)這種性別差異可能與性激素和免疫密切相關(guān)［9］。

性激素可以與免疫細胞核中的性激素受體相結(jié)合，通過固有免疫和獲得性免疫影響HBV 的感染以及HBV 相關(guān)性疾病的發(fā)生發(fā)展［10］。研究發(fā)現(xiàn)雌激素更多地發(fā)揮免疫促進作用，而雄激素則發(fā)揮免疫抑制作用［10］。除此之外，性激素也可以直接作用于肝細胞上的雄激素受體和雌激素受體α，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄［11］。有研究表明，雄激素可促進雄激素受體與HBV 增強子Ⅰ中的兩個雄激素反應(yīng)元件結(jié)合，從而促進HBV 的復(fù)制［12-13］。雌二醇作用于肝細胞，可以誘導(dǎo)雌激素受體α 的合成，而雌激素受體α 可以與HBV 增強子Ⅰ競爭性結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子肝細胞核因子4α（hepatocyte nuclear factor 4α，HNF4α），從而抑制HBV 的轉(zhuǎn)錄功能［14］。而雌三醇（estriol，EST）作為雌激素中的一種，對HBV 復(fù)制的調(diào)控作用尚未見報道。因此，本課題組將利用穩(wěn)定表達HBV 基因的HepG2.2.15 細胞 和 HBV 感染模型 HepG2-NTCP 細胞研究雌三醇對HBV轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的調(diào)控作用。

材 料 和 方 法

1 材料

HepG2.2.15 和HepG2-NTCP 細胞由本實驗室保存。DMEM 培養(yǎng)液、胰酶和胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自Gibco；G418購自Merck；MTS試劑盒購自Promega；RNA 提取試劑TRIzol 和逆轉(zhuǎn)錄酶購自天根生化科技有限公司；SYBR Green Master 購自Roche；HBsAg 和乙型肝炎e 抗原（hepatitis B e antigen，HBeAg）ELISA 檢測試劑盒購自上海科華生物工程股份有限公司；HBV 轉(zhuǎn)基因小鼠（C57BL/6）為廈門大學夏寧邵教授所贈；天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

2 方法

2.1 細胞的培養(yǎng) HepG2.2.15 細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清和400 mg/L G418 的DMEM 培養(yǎng)液中，HepG2-NTCP 細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1 mg/L嘌呤霉素的DMEM 培養(yǎng)液中，所有細胞均在37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。

2.2 動物實驗設(shè)計 HBV轉(zhuǎn)基因小鼠（C57BL/6）飼養(yǎng)于無特定病原體的條件下。取15 只6 周齡、體重相近（20～22 g）且HBV DNA 水平相近的雄性HBV 轉(zhuǎn)基因小鼠，隨機分成3 組，即對照組、恩替卡韋（entecavir，ETV）組和雌三醇組，每組5 只。雌三醇粉末溶于DMSO，并用生理鹽水稀釋1 000 倍。結(jié)合文獻報道［15］，在不損傷肝功能的前提下確定雌三醇組給藥劑量為5 mg/kg，ETV組給藥劑量為0.02 mg/kg，對照組注射含1‰DMSO 的生理鹽水，采用腹腔注射的方式給藥，每2 d給藥一次。4周后，采用眼眶取血的方法收集小鼠血清，并處死小鼠，分離出肝臟。

2.3 HepG2-NTCP 細胞感染HBV 病毒粒子 HBV病毒粒子來源于HepAD38 細胞培養(yǎng)上清，經(jīng)濃縮定量后，于-80℃分裝保存。接種8×105個HepG2-NTCP細胞于預(yù)先用膠原鋪板的6 孔板中，1 d 后用感染培養(yǎng)液換液，換液1 d 后感染HBV 病毒粒子，感染復(fù)數(shù)為 1 000，1 d 后棄去細胞培養(yǎng)上清，PBS 清洗 2 次后用感染培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

2.4 MTS 實驗 接種 2×104個細胞于 96 孔板，第 2天加入不同濃度（從 640 μmol/L 到 5 μmol/L 倍比稀釋）的雌三醇，3 d 更換一次培養(yǎng)液，第6 天在培養(yǎng)液中加入20 μL MTS 試劑盒中的溶解試劑，5% CO2、37℃孵育1 h后，490 nmol/L下讀取吸光度。

2.5 RT-qPCR 檢測HBV RNA 采用TRIzol 法裂解細胞提取總RNA，取1 μg RNA 按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將其逆轉(zhuǎn)錄cDNA，RT-qPCR 檢測目的基因的mRNA 水平。反應(yīng)條件為:94℃ 20 s，60℃ 20 s，72℃20 s，循環(huán)34次。HBV RNA 上游引物序列為5'-ACCGACCTTGAGGCATACTT-3'，下游引物序列為5'-GCCTACAGCCTCCTAGTACA-3'；內(nèi)參照 β-actin上游引物序列為5'-CTCTTCCAGCCTTCCTTCCT-3'，下游引物序列為5'-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3'。每個樣本均設(shè)3個復(fù)孔，每組實驗重復(fù)3次。

2.6 RT-qPCR 檢測HBV DNA 用0.5 mL裂解緩沖液［10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）、1 mmol/L EDTA、1% NP-40 和2% sucrose］于37℃裂解細胞15 min，離心去除細胞碎片，加入5 μL 的 1 mol/L MgCl2和 4 μL的 1×105U/L DNase I，37℃孵育 4 h，加入 200 μL 35% PEG-8000，冰浴1 h；4℃、12 000×g離心5 min，棄上清；加入 500 μL 蛋白酶 K 消化液［0.5% SDS、150 mmol/L NaCl、25 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）和10 mmol/L EDTA］和終濃度為500 mg/L 的蛋白酶K，45℃孵育過夜后用酚氯仿抽提，異丙醇沉淀，70%乙醇洗滌，TE 緩沖液溶解HBV DNA。按照SYBR Green 說明書配制反應(yīng)體系和設(shè)置反應(yīng)條件。反應(yīng)條件為:94℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 20 s，循環(huán)39 次。細胞中HBV core DNA 的上游引物序列為5'-CCTAGTAGTCAGTTATGTCAAC-3'，下游引物序列為5'-TCTATAAGCTGGAGGAGTGCGA-3'；小鼠血清和肝組織中 HBV DNA 的上游引物序列為 5'-CCTCTTCATCCTGCTGCT-3'，下游引物序列為5'-AACTGAAAGCCAAACAGTG-3'。每個樣本均設(shè)3 個復(fù)孔，每組實驗重復(fù)3次。

3 統(tǒng)計學處理

采用GraphPad Prism 7.0 統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 雌三醇對HepG2.2.15 和HepG2-NTCP 細胞活力的影響

為了驗證雌三醇對HBV 復(fù)制的影響，我們首先檢測了雌三醇對HepG2.2.15 和HepG2-NTCP 細胞的毒性。MTS 結(jié)果顯示，雌三醇對HepG2.2.15 細胞的半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）為 181.5 μmol/L，對 HepG2-NTCP 細胞的IC50為218.6 μmol/L，見圖1。

Figure 1.Effect of estriol（EST）on the viability of HepG2.2.15（A）and HepG2-NTCP（B）cells measured by MTS assay.Mean±SD. n=3.圖1 雌三醇對HepG2.2.15和HepG2-NTCP細胞活力的影響

2 雌三醇對HepG2.2.15細胞中HBV復(fù)制的影響

在雌三醇IC50范圍內(nèi)，我們選取10、20 和40 μmol/L 雌三醇作用于HepG2.2.15 細胞，并以25 nmol/L ETV（據(jù)文獻報道該濃度下ETV 顯著抑制HBV 復(fù)制［15］）為陽性對照。6 d 后，RT-qPCR 結(jié)果顯示，不同濃度雌三醇處理后，HepG2.2.15 細胞中HBV core DNA 水平分別下降37%、50%和65%（圖2A），HBV RNA 水平分別下降19%、38%和54%（圖2B）；ELISA 結(jié)果顯示，細胞培養(yǎng)上清中HBsAg 水平分別下降16%、29%和36%，HBeAg 水平分別下降20%、33%和41%（圖2C、D）。

3 雌三醇對HepG2-NTCP 細胞中HBV 復(fù)制的影響

牛磺膽酸鈉共轉(zhuǎn)運多肽（sodium taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP）是 HBV 感染肝細胞的受體，HepG2-NTCP 細胞能夠模擬自然狀態(tài)下HBV 的復(fù)制過程。進一步，我們利用此模型研究了雌三醇對HBV 復(fù)制的影響。我們對感染HBV 的HepG2-NTCP 細胞分別用 10、20 和 40 μmol/L 雌三醇處理，并以25 nmol/L ETV 為陽性對照，6 d 后，RT-qPCR結(jié)果顯示，HepG2-NTCP細胞中HBV core DNA水平分別降低27%、40%和57%（圖3A），HBV RNA水平分別降低16%、32%和49%（圖3B）；ELISA 結(jié)果顯示，HBsAg 水平分別降低17%、26%和33%，HBeAg水平分別降低19%、31%和41%（圖3C、D）。

Figure 2.Effect of estriol（EST）on HBV replication in HepG2.2.15 cells.HepG2.2.15 cells were cultured with EST（10，20 and 40 μmol/L）for 6 d，and entecavir（ETV，25 nmol/L）was used as positive control.A，B:HBV DNA and RNA levels were detected by RT-qPCR；C，D:the levels of HBsAg and HBeAg in cell supernatants were determined by ELISA.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.圖2 雌三醇對HepG2.2.15細胞中HBV復(fù)制的影響

4 雌三醇在HBV轉(zhuǎn)基因小鼠模型中的抗病毒效能

為了進一步證明雌三醇在體內(nèi)對HBV 轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的調(diào)控作用，我們研究了雌三醇對HBV 轉(zhuǎn)基因小鼠中HBV 轉(zhuǎn)錄和復(fù)制水平的影響。雌三醇組小鼠血清中ALT 和AST 的水平與對照組相比無顯著差異（圖4A、B），表明雌三醇對小鼠肝臟無毒性影響。RT-qPCR 檢測血清中 HBV DNA 水平及 ELISA 檢測血清HBsAg 和HBeAg 水平的結(jié)果顯示，與對照組相比，雌三醇組血清HBV DNA 水平下降58%，ETV 組血清HBV DNA 水平下降97%（圖4C），雌三醇組血清HBsAg 和HBeAg 水平分別下降39%和37%，而ETV 組HBsAg 和HBeAg 水平變化無統(tǒng)計學顯著性（圖4D、E）。RT-qPCR 檢測肝組織中 HBV DNA 和RNA 水平的結(jié)果顯示，與對照組相比，雌三醇組和ETV 組HBV DNA 水平分別下降55%和98%（圖4F），雌三醇組 HBV RNA 水平下降 46%，而 ETV 組HBV RNA水平變化無統(tǒng)計學顯著性（圖4G）。

討 論

雌激素及雌激素受體在HBV 感染及相關(guān)肝病中的作用已比較明確［16-17］。存在于人體中的雌激素有3 種，包括雌二醇、雌酮和雌三醇，其中雌二醇可通過上調(diào)雌激素受體的表達而抑制HBV 的轉(zhuǎn)錄活性，發(fā)揮抑制 HBV 復(fù)制的作用［18］，而雌三醇作為雌二醇的代謝產(chǎn)物，在HBV 復(fù)制和轉(zhuǎn)錄中的作用目前尚無報道。本研究首先利用HBV 穩(wěn)定表達細胞模型HepG2.2.15 細胞和HBV 感染細胞模型HepG2-NTCP 細胞研究了雌三醇對HBV 復(fù)制的調(diào)控作用。在HBV 生活周期中，HBV 的復(fù)制過程首先由HBV 的共價閉合環(huán)狀DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）轉(zhuǎn)錄成不同大小的HBV RNAs，并表達HBV蛋白，HBV RNAs 中的3.5 kb RNA 可作為模板逆轉(zhuǎn)錄形成HBV DNA。我們的細胞研究結(jié)果顯示，在IC50范圍內(nèi)雌三醇明顯下調(diào)了HBV RNA 和DNA 水平以及HBsAg和HBeAg分泌水平，并呈濃度依賴性，表明雌三醇在體外可顯著抑制HBV 生活周期中的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過程。為了證實研究結(jié)果的可靠性，我們又利用HBV 轉(zhuǎn)基因小鼠模型證實了雌三醇在體內(nèi)也具有較強的抑制HBV 轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的作用，這些研究結(jié)果充分證實了雌三醇對HBV 復(fù)制過程發(fā)揮負向調(diào)控作用。

Figure 3.Effect of estriol（EST）on HBV replication in HepG2-NTCP cells.After infected with HBV，HepG2-NTCP cells were cultured with EST（10，20 and 40 μmol/L）for 6 d，and entecavir（ETV，25 nmol/L）was used as positive control.A，B:HBV DNA and RNA levels were detected by RT-qPCR；C，D:the levels of HBsAg and HBeAg in cell supernatants were determined by ELISA.Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.圖3 雌三醇對HepG2-NTCP細胞中HBV復(fù)制的影響

Figure 4.Antiviral efficacy of estriol in HBV transgenic mice.The male transgenic mice were intraperitoneally injected with estriol（5 mg/kg），and entecavir（ETV，0.02 mg/kg）was used as positive control.A，B:ALT and AST levels were detected by ELISA；C:serum HBV DNA level was measured by RT-qPCR；D，E:the serum levels of HBsAg and HBeAg were tested by ELISA；F，G:liver HBV DNA and RNA level were analyzed by RT-qPCR.Mean±SD. n=5.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.圖4 雌三醇在HBV轉(zhuǎn)基因小鼠模型中的抗病毒效能

經(jīng)典的性激素發(fā)揮生理效應(yīng)的過程是通過活化相應(yīng)的激素受體受體，形成激素-受體復(fù)合體，從而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的作用，控制下游靶基因表達［19-20］。雌二醇也主要是通過上調(diào)雌激素受體的表達，抑制轉(zhuǎn)錄因子HNF4α 與HBV 增強子Ⅰ的結(jié)合，從而抑制HBV 的轉(zhuǎn)錄過程［10］。我們的研究結(jié)果證實，雌三醇可下調(diào)HBV RNA 水平、HBV 蛋白水平及HBV DNA 水平，結(jié)合雌二醇的作用機制，我們推測雌三醇可能抑制了HBV 的轉(zhuǎn)錄過程，進而抑制了HBV 的復(fù)制。下一步，我們將研究雌三醇對HBV 增強子和啟動子活性的影響，篩選雌三醇調(diào)控HBV 增強子或啟動子活性的轉(zhuǎn)錄因子，以闡明雌三醇調(diào)控HBV轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的分子機制。

綜上所述，雌三醇是一種HBV 復(fù)制過程的抑制因子，可能是通過下調(diào)HBV 轉(zhuǎn)錄水平而抑制了HBV的復(fù)制。