孫 澎， 劉利思， 王 剛， 黃世光

（1暨南大學第二臨床醫(yī)學院，深圳市人民醫(yī)院口腔醫(yī)學中心，廣東深圳518020；2暨南大學口腔醫(yī)學院，廣東廣州510632；3中山大學附屬中山醫(yī)院口腔分院牙體牙髓病科，廣東中山528403）

含T 細胞免疫球蛋白和黏蛋白結構域蛋白（T-cell immunoglobulin and mucin domain-containing protein，Tim）家族是T細胞表面的跨膜蛋白家族。目前發(fā)現(xiàn)在人類 Tim 家族中有 3 個蛋白（Tim-1、Tim-3 和Tim-4），其基因定位于染色體5q33.2區(qū)域，與變應性鼻炎、超敏反應、哮喘和免疫缺陷密切相關［1-2］。Tim-3 為輔助性T 細胞1（T helper 1 cells，Th1 細胞）表面標志分子，也可表達在調節(jié)性T 細胞（regulatory T cells，Treg）、Th17 細胞、內皮細胞、巨噬細胞（macrophages，Mφ）及樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）上，在腫瘤細胞，如胃癌和黑色素瘤細胞上亦有表達［1，3］。半乳糖凝集素 9（galectin-9，Gal-9）是Tim-3的配體之一。研究顯示，Tim-3 與Gal-9 結合可對Th1 細胞的免疫功能產生負向調節(jié)而導致Th1 細胞死亡，結合體內阻斷實驗結果提示Tim-3可能是終止Th1 細胞免疫應答的抑制性分子［4］。Mφ 在固有免疫及適應性免疫反應中發(fā)揮重要作用，在炎癥過程中當病原體侵入宿主后，Mφ 可有效清除病原體。Mφ作為牙周疾病中重要的免疫活性細胞，在免疫應答反應、病損發(fā)展、長期炎癥等方面有重要地位［5］。研究表明，組織內環(huán)境及細胞因子的變化、病程的演變等在不同疾病中均可誘導產生不同類型的Mφ 來介導炎癥反應［6］。CD68是分布于細胞表面的相對分子質量為110 kD的跨膜糖蛋白，在單核細胞表面較少，但向Mφ 轉化后表達增加，因此CD68 是常用于鑒定Mφ 的表面標志物［7-10］。目前，在人慢性牙周炎組織Mφ 上Tim-3 和Gal-9 的表達情況尚未見報道。本研究采用免疫熒光雙染色法，觀察人慢性牙周炎牙齦組織標本中CD68-Tim-3 雙陽性細胞和CD68-Gal-9雙陽性細胞的表達情況，探討慢性牙周炎牙周組織破壞程度與Tim-3和Gal-9在Mφ上表達的關系。

材 料 和 方 法

1 研究對象

1.1 病例選擇 選擇2018年8月～2019年4月在暨南大學第二臨床醫(yī)學院口腔醫(yī)學中心口腔頜面外科和牙周病科就診的自愿接受本次研究的患者，年齡16～65歲，其中男性43名，年齡（39.0±15.1）歲，女性37名，年齡（34.0±13.9）歲。受試者均無系統(tǒng)性疾病如血液病、糖尿病、類風濕性關節(jié)炎等；近3個月未服用激素類藥物或抗生素；女性受試者為非妊娠或哺乳期；1年內未接受過牙周手術治療。慢性牙周炎的納入標準依據(jù)1999 年美國牙周病學會的牙周病新分類［11］。操作符合人體試驗委員會制定的倫理學標準并獲得批準，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 分組及取材 （1）健康對照組20 例:牙齦無炎癥，無附著喪失（attachment loss，AL），X 線照片顯示無牙槽骨吸收，取自因正畸需要拔除的前磨牙或牙周健康的智齒；（2）輕度慢性牙周炎組20例:牙齦有炎癥，牙周袋≤4 mm，AL 1～2 mm，X 線照片顯示牙槽骨吸收≤根長1/3，取自因需要接受臨床牙冠延長術者；（3）中度慢性牙周炎組20 例:牙齦有明顯炎癥，探診明顯出血，也可有膿，X 線照片顯示牙槽骨吸收超過根長的1/3，但不超過根長的1/2，牙齒可出現(xiàn)松動，多根牙可出現(xiàn)根分叉感染，取自需要接受牙周翻瓣術的內斜切口牙齦組織；（4）重度牙周炎組20例:取自牙周翻瓣術中切取、無法保留或預后差的需拔牙的重度牙周炎患者，牙齦有明顯炎癥，牙周袋＞6 mm，AL≥5 mm，X 線照片顯示牙槽骨吸收＞根長1/2，甚至達到根長的2/3，牙齒松動III度［12］。

2 實驗方法

2.1 組織標本的采集和處理 按照分組條件采集的各組牙齦組織標本于4%甲醛溶液中固定超過48 h，隨后脫水、石蠟包埋，制成5 μm 厚頰舌向牙齦組織連續(xù)切片，行HE染色。

2.2 CD68-Tim-3 雙陽性細胞和CD68-Gal-9 雙陽性細胞免疫熒光雙染色 I 抗:CD68 抗體（Abcam），稀釋比1∶100；Tim-3 抗體（武漢博士德），稀釋比1∶200；Gal-9抗體（武漢博士德），稀釋比1∶200。Ⅱ抗:山羊抗小鼠IgG（H+L）Alex Flour?555 和山羊抗兔IgG（H+L）Alex Flour?488（Cell Signaling Technology），稀釋比1∶200。組織切片經脫蠟、復水，在修復盒經微波爐加熱修復抗原；遮光條件下采用牛血清白蛋白孵育、Ⅰ抗孵育、Ⅱ抗孵育，封片并立即在熒光顯微鏡下觀察拍照。DAPI 核染為藍色熒光，Tim-3 陽性和Gal-9 陽性信號為紅色熒光，CD68 陽性信號顯現(xiàn)為綠色熒光，定位于細胞膜或細胞漿，紅光和綠光在顯微鏡同一視野下重疊后為橘黃色熒光。由2 名病理醫(yī)師觀察免疫熒光雙染色切片中CD68-Tim-3和CD68-Gal-9雙陽性細胞的個數(shù)，并通過測量組織面積以獲得每mm2的細胞個數(shù)，再取其平均值。

3 統(tǒng)計學處理

對取得的計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示，采用統(tǒng)計軟件SPSS 13.0 分析處理。CD68-Tim-3 和CD68-Gal-9 雙陽性細胞平均密度的比較采用單因素方差分析。采用Levene法進行方差齊性檢驗，若方差齊時，兩兩比較選用Bonferroni 法，方差不齊時選用Tamhane's T2 法。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 組織學觀察結果

HE 染色結果顯示，健康對照組結締組織中未見明顯炎癥細胞浸潤，見圖1A；輕度慢性牙周炎組可見淋巴細胞及漿細胞少量散在分布，見圖1B；中度慢性牙周炎組可見較多的慢性炎癥細胞（如淋巴細胞、中性粒細胞等）浸潤，呈局灶狀，見圖1C；重度慢性牙周炎組可見固有層中大量炎癥細胞（如漿細胞、淋巴細胞、肥大細胞等）聚集，見圖1D。

Figure 1.HE staining of human gingival tissues（scale bar=50 μm）.A:healthy control group；B:slight chronic periodontitis group；C:moderate chronic periodontitis group；D:severe chronic periodontitis group.圖1 各組牙齦組織HE染色結果

2 CD68-Tim-3雙陽性細胞雙染色結果

免疫熒光染色結果顯示，各組牙齦組織中Mφ均表達Tim-3。健康對照組牙齦組織中只觀察到極少量的CD68-Tim-3 雙陽性細胞；輕度慢性牙周炎組CD68-Tim-3 雙陽性細胞呈散在分布，且密度較健康對照組顯著增加；中度慢性牙周炎組CD68-Tim-3 雙陽性細胞顯著增加；重度牙周炎組牙齦組織中可見大量CD68-Tim-3 雙陽性細胞；各組牙齦組織標本的陰性對照未見熒光表達。統(tǒng)計CD68-Tim-3 雙陽性細胞的密度，結果顯示，慢性牙周炎組CD68-Tim-3雙陽性細胞密度均比健康對照組高（P＜0.01）；中度慢性牙周炎組CD68-Tim-3 雙陽性細胞密度較輕度慢性牙周炎組顯著升高（P＜0.01）；重度慢性牙周炎組CD68-Tim-3 雙陽性細胞密度較輕、中度慢性牙周炎組顯著升高（P＜0.01）。見圖2。

3 CD68-Gal-9雙陽性細胞雙染色結果

免疫熒光染色結果顯示，各組牙齦組織中Mφ均表達Gal-9。健康對照組牙齦組織中只觀察到極少量的CD68-Gal-9 雙陽性細胞；輕度慢性牙周炎組CD68-Gal-9 雙陽性細胞呈散在分布，且密度較健康對照組顯著增加；中度慢性牙周炎組CD68-Gal-9 雙陽性細胞顯著增加；重度牙周炎組牙齦組織中可見大量CD68-Gal-9 雙陽性細胞；各組牙齦組織標本的陰性對照未見熒光表達。統(tǒng)計CD68-Gal-9雙陽性細胞的密度，結果顯示，CD68-Gal-9雙陽性細胞密度在慢性牙周炎組均比健康對照組高（P＜0.01），在中度慢性牙周炎組較輕度慢性牙周炎組顯著升高（P＜0.01），在重度慢性牙周炎組較輕、中度慢性牙周炎組顯著升高（P＜0.01）。見圖3。

討 論

牙周炎是牙齒支持組織的慢性感染性疾病，菌斑微生物通過介導免疫細胞分泌細胞因子引發(fā)的宿主免疫反應決定牙周炎的進展［13］。Mφ 作為宿主免疫反應的重要組成部分，在組織損傷或病原菌侵入時，可通過其表面的Toll 樣受體（Toll-like receptors，TLR）識別清除病原菌并分泌多種細胞因子調節(jié)機體免疫反應，激活適應性免疫應答，在免疫反應中起主要作用［14］。大量研究表明，Mφ 參與牙周炎的發(fā)生發(fā)展。Mφ 作為牙周組織對抗牙周致病菌的第1道防線，通過吞噬作用清除病原體而減輕炎癥，但是其過度活化可破壞牙周組織，加重牙周炎的進程。有研究顯示，牙周組織中的Mφ 主要為M1 型Mφ，同時可觀察到少量M2 型Mφ，齦溝液中可檢測到大量促炎因子和骨吸收因子，故M1 型Mφ 在牙周炎的發(fā)生發(fā)展中起主要作用［］。CD68 是Mφ 譜系中高度特異性表達的蛋白質，可作為Mφ 的標志物［7-10］。本實驗對慢性牙周炎患者的牙齦組織標本進行免疫熒光染色觀察到，與健康對照組相比，慢性牙周炎牙齦組織中有大量CD68+細胞浸潤，且CD68+陽性細胞的數(shù)量隨著牙周炎病變程度的加重而顯著上升，與Golijanin 等［17］的結果一致，表明 Mφ 譜系的 CD68+細胞參與牙周炎的進程。

Tim-3 作為Tim 超家族的一個成員，近年來被發(fā)現(xiàn)是一種免疫調控分子。Tim-3 被證實在免疫應答反應中起抑制性調節(jié)作用，與程序細胞死亡蛋白1（programmed cell death protein 1，PD-1）作用類似，主要促進T 淋巴細胞發(fā)生凋亡并誘導免疫耐受的發(fā)生［18］。Gal-9 是半乳糖結合蛋白家族的成員，N 端和C 端兩個CRD 區(qū)域共同組成了Gal-9 的結構，主要決定T 淋巴細胞的受體識別及死亡信號的啟動［19］。目前，許多研究者認為Gal-9 是一種能影響多種免疫細胞的多效性調節(jié)分子［20］。Gal-9 是 Tim-3 的配體，在結構上是一種獨特的“串聯(lián)重復序列”。研究發(fā)現(xiàn)Tim-3-Gal-9信號通路在免疫逃逸機制中發(fā)揮關鍵作用［4］。Tim-3 和 Gal-9 結合可誘導 CD4+、CD8+T 細胞凋亡，阻斷Tim-3/Gal-9 可增加效應和記憶性CD8+T細胞的數(shù)量。CD8+T 細胞受抗原刺激后主要分化為Th1 和 Th2 細胞［4］。研究顯示，介導細胞免疫的 Th1和介導體液免疫的Th2 間的平衡與慢性牙周炎的間歇性和進展性有關［21］。慢性牙周炎早期階段，在多形核中性粒細胞和Mφ 分泌的IL-12 的介導下，激發(fā)機體固有免疫功能，導致Th1 免疫應答，Th1 細胞所產生的干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）參與Mφ 活化，產生M1型Mφ，誘導炎癥因子（如IL-1β、IL-2及IL-6）的產生，促進炎癥細胞聚集和破骨細胞形成，加重炎癥反應和牙槽骨的破壞，同時上調Gal-9 的表達產生負反饋調節(jié)，導致Tim-3+Th1 細胞發(fā)生凋亡［22-23］。當牙周炎進行性破壞發(fā)展到晚期，Th2 細胞介導的體液免疫應答占主導地位，IL-4和IL-13等可參與調節(jié)B 細胞的免疫炎癥反應并極化Mφ 為M2 型Mφ，通過產生IL-10、轉化生長因子β 等抗炎型細胞因子抑制炎癥反應，在炎癥后期階段促進局部組織修復和再生，調節(jié)機體免疫平衡［15］。研究顯示，Th1 細胞的Tim-3表達與IFN-γ呈負相關，而Th2細胞的Tim-3與IL-4無關，提示Tim-3可能參與Th1/Th2平衡改變，下調Th1 免疫應答可能影響Th1/Th2 免疫應答平衡，促使免疫逃逸［21］。同時，有研究報道，病原感染而誘導Mφ 表達Tim-3 上調，可能參與該類細胞的激活及細胞因子分泌［24］。此外，Tim-3 可抑制致病性促炎M1型Mφ 的極化，而下調或阻斷Tim-3 可致M1 反應增加并增強炎癥反應，因此Tim-3 過表達可降低M1 型Mφ 的反應以減弱炎癥［24-26］。de Oliveira 等［27］在根尖周疾病的研究觀察到，Tim-3/Gal-9 可能介導Mφ 極化，Tim-3 可抑制致病性促炎M1 型Mφ 極化，而下調或者阻斷Tim-3 可致M1 反應增加，增強炎癥反應。這些結果均提示Tim-3 和Gal-9 可通過調節(jié)Mφ 的作用而參與炎癥反應。

Figure 2.Densities of CD68-Tim-3 double positive cells in gingival tissues（scale bar=50 μm）.Mean±SD. n=20. *P＜0.01 vs healthy control group；#P＜0.01 vs slight chronic periodontitis group；△P＜0.01 vs moderate chronic periodontitis group.圖2 各組牙齦組織CD68-Tim-3雙陽性細胞比較

Figure 3.Densities of CD68-Gal-9 double positive cells in gingival tissues（scale bar=50 μm）.Mean±SD. n=20. *P＜0.01 vs healthy control group；#P＜0.01 vs slight chronic periodontitis group；△P＜0.01 vs moderate chronic periodontitis group.圖3 各組牙齦組織CD68-Gal-9雙陽性細胞比較

目前，Tim-3 及其配體Gal-9 在人慢性牙周炎牙齦組織Mφ 上的表達情況尚未清楚。本研究通過免疫熒光雙染色，首次證實了在人慢性牙周炎牙齦組織的Mφ 可表達Gal-9 和Tim-3。同時，結果顯示CD68-Tim-3雙陽性細胞和CD68-Gal-9雙陽性細胞數(shù)量隨牙周炎病變程度加重而增多，提示Gal-9 和Tim-3陽性細胞可能參與慢性牙周炎的病程發(fā)展。Tim-3可通過與其配體Gal-9結合識別Mφ并調節(jié)其吞噬作用。結合Tim-3-Gal-9信號通路在免疫逃逸機制中的研究，我們的結果提示 Gal-9 和 Tim-3 陽性 Mφ 對慢性牙周炎可能具有促進作用，但Gal-9 和Tim-3 陽性Mφ 如何參與慢性牙周炎的免疫調控機制尚不清楚，有待進一步研究。