蔡志波， 林 艷， 陳英虎

（浙江大學醫(yī)學院附屬兒童醫(yī)院/國家兒童健康與疾病臨床醫(yī)學研究中心 1藥劑科，2感染科，浙江杭州310052）

類風濕關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）不僅是一種以慢性破壞性關節(jié)病變?yōu)樘卣鞯淖陨砻庖咝约膊。?］，也是世界范圍內(nèi)導致人們殘疾的主要病因［2］，同時還給患者家庭和社會帶來巨大的經(jīng)濟負擔。由于人們對RA 發(fā)病和進展機制尚不完全清楚，因此，目前尚無特異性治療RA 的策略，且許多常用的RA非特異性治療藥物具有眾多副作用［3］。因此，對RA的發(fā)病和進展機制以及抗RA 藥物的篩選仍需持續(xù)研究。

黃芩苷（baicalin，Bai）是從黃芩苷根中提取的黃酮類單體之一，可用于支氣管炎、上呼吸道感染、風濕痛和關節(jié)痛的治療。近年來研究［4-6］報道，黃芩苷可通過維持輔助性T 細胞17（T helper 17 cells，Th17）/調(diào)節(jié)性T 細胞（regulatory T cells，Treg）反應平衡來減輕過敏性哮喘、佐劑誘導性關節(jié)炎和實驗性自身免疫性腦脊髓炎模型小鼠的免疫炎癥反應。膠原蛋白誘發(fā)性關節(jié)炎（collagen-induced arthritis，CIA）小鼠模型與人RA 在病因和病理學改變相似［7］。而黃芩苷對CIA 的具體作用和機制尚不完全清楚，仍需進一步研究。因此，本研究通過觀察黃芩苷對CIA 小鼠炎癥反應和Th17 細胞比例的影響，并分析其潛在的機制。

材 料 和 方 法

1 試劑

黃芩苷（純度＞98%）購自上海純優(yōu)生物科技有限公司；雞源II 型膠原蛋白（chick collagen type II，CII）、完全弗氏佐劑（complete Freund's adjuvant，CFA）、不完全弗氏佐劑（incomplete Freund's adjuvant，IFA）、佛波酯（phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA）和離子霉素購自Sigma-Aldrich；小鼠白細胞介素 1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子 α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）和 IgG2a 的 ELISA 試劑盒購自深圳市達科為生物技術股份有限公司；小鼠IL-17A ELISA試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；抗B淋巴細胞刺激物（B-lymphocyte stimulator，BLyS）抗體購自Santa Cruz；莫能霉素、小鼠白細胞分化抗原4（cluster of differentiation 4，CD4）和IL-17A 抗體購自BD Biosciences；小鼠CD4+T 細胞分離試劑盒購自Miltenyi Biotec；小鼠可溶性BLyS購自Peprotech。

2 實驗動物

40 只 7 周齡 SPF 級雄性 DBA/1 小鼠（18～20 g）購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。將小鼠飼養(yǎng)在22～24℃、50%～60%濕度和12 h/12 h 明暗循環(huán)的SPF 動物房中，小鼠可自由飲食飲水。小鼠適應飼養(yǎng)1周后進行CIA造模。

3 方法

3.1 CIA 造模與分組 小鼠分為正常小鼠組（n=8）和關節(jié)炎小鼠組（n=32）。通過CII 誘導法構(gòu)建關節(jié)炎小鼠模型［8］，首先將CII溶于0.1 mol/L 的冰醋酸制成濃度為1 g/L 的溶液，并與等量的CFA 或IFA 混合成乳劑，然后在第1天取0.2 mL CII與CFA混合的乳劑于小鼠背部皮下分4 個部位注射致敏，第21 天取0.2 mL CII與IFA 混合的乳劑于小鼠尾根部皮下分4個部位注射強化免疫。關節(jié)炎小鼠分為4 個亞組，分別是CIA 亞組及黃芩苷低、中和高劑量處理亞組，每個亞組包含8 只小鼠；其中黃芩苷低、中和高劑量處理亞組小鼠在第28 天起通過灌胃方式分別給予50、100 和 200 mg·kg-1·d-1黃芩苷，持續(xù) 14 d［5-6］；CIA亞組在第28 天起通過灌胃方式給予等體積生理鹽水，持續(xù)14 d。正常小鼠第1 天和21 天注射0.2 mL 0.1 mol/L 的冰醋酸（方式同CIA 造模方式），并在第28 天起通過灌胃方式給予等體積生理鹽水，持續(xù)14 d。

3.2 各組小鼠關節(jié)炎指數(shù)（arthritis index，AI）的評估 采用AI 積分評價第42 天時各組小鼠關節(jié)炎癥程度。根據(jù)踝關節(jié)和趾之間病變程度分別對小鼠每只爪進行打分:0 分，無紅腫現(xiàn)象；1 分，趾關節(jié)或踝關節(jié)呈現(xiàn)紅斑和輕度腫脹；2 分，踝關節(jié)蔓延至足跖中段均呈現(xiàn)紅斑和輕度腫脹；3 分，踝關節(jié)、足爪和趾均呈現(xiàn)紅斑和中度腫脹；4 分，踝關節(jié)、足爪和趾均呈現(xiàn)紅斑和重度腫脹。4 只爪的AI 分數(shù)之和為每只小鼠的總AI積分。

3.3 血液和組織樣本收集 在第42 天，麻醉各組小鼠并脫頸處死，每只小鼠收集2 mL 頸動脈血，并收集小鼠后腿膝關節(jié)、脾臟和腸系膜淋巴結(jié)（mesenteric lymph nodes，MLN）組織樣本。

3.4 ELISA 檢測 取各組小鼠血液樣品至于4℃冰箱中呈45度角靜置1 h，然后3 000×g離心5 min收集血清。取各組小鼠后腿膝關節(jié)組織，用RIPA 裂解液進行勻漿，并收集組織勻漿液。分別取血清和組織勻漿液按照ELISA 試劑盒說明書步驟進行ELISA 反應。顯色后，使用全自動酶標儀（Thermo Scientific）檢測波長540 nm（用于IL-1β 和TNF-α 測定）和450 nm（用于IgG、IgG2a 和IL-17A 測定）處的吸光度（A），然后根據(jù)標準曲線計算血清中IL-1β、TNF-α、IL-17A、IgG 和 IgG2a 的含量和膝關節(jié)組織中 IL-17A 的含量。

3.5 后腿膝關節(jié)HE 染色 取各組小鼠后腿膝關節(jié)組織并用4%甲醛固定48 h，5%硝酸脫鈣2 h，在二甲苯浸泡后將組織包埋在石蠟中，制作5 μm 厚度的石蠟切片，并行常規(guī)HE 染色。HE 染色后，用DP73顯微鏡（Olympus）觀察組織形態(tài)變化，并隨機獲取4個不同視野的圖像。HE 染色組織病理學圖像使用炎癥細胞浸潤、滑膜成纖維細胞增生和關節(jié)腔損傷的參數(shù)積分計算軟骨評分。每個參數(shù)的評分范圍為0～4，其中0代表正常表型，4代表最嚴重的變化，3個參數(shù)的評分之和為軟骨評分。

3.6 流式細胞術分析CD4+IL-17A+T細胞比例 從各組小鼠的脾臟組織和MLN 組織中分離出單核細胞懸液，用PMA（100 μg/L）、離子霉素（500 μg/L）和莫能霉素（2 μmol/L）刺激4 h 后，在4°C 的暗室下分別孵育1:1 000 稀釋比例的抗CD4（PE）和抗IL-17A（FITC）單克隆抗體30 min。用FACS CantoTMII 流式細胞儀（BD）通過CD4+門控圈出Th 細胞，然后生成流式散點圖，并使用FlowJo 7.6.1 軟件分析CD4+IL-17A+T細胞比例。

3.7 Western blot檢測 取各組小鼠后腿膝關節(jié)、脾臟和MLN組織樣品，并分別用RIPA裂解液提取總蛋白。蛋白經(jīng)BCA 法定量后，用常規(guī)Western blot 法檢測組織中BLyS蛋白表達。BLyS和GAPDH 抗體的稀釋比例分別為 1∶2 000 和1∶8 000。用ECL 發(fā)光液將目的條帶曝光于膠片，并用ImageJ 軟件量化目的條帶灰度值。

3.8 細胞學實驗 取正常小鼠的脾臟，按照小鼠CD4+T 細胞分離試劑盒說明書步驟，通過磁珠法分離CD4+T 細胞亞群。CD4+T 細胞亞群接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基中，并分為對照（control，Con）組（常規(guī)培養(yǎng) 48 h）、BLyS 組（添加 2 μg/L BLyS 處理 48 h）和 BLyS+Bai 組（添加 2 μg/L BLyS 和20 μmol/L黃芩苷處理48 h）。處理結(jié)束后，收集細胞上清液用于檢測上清液中IL-1β 和TNF-α 水平（檢測方法同3.4）；收集細胞用于分析CD4+IL-17A+T細胞比例（檢測方法同3.6）。

4 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標準差（mean±SD），使用SPSS 17.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 黃芩苷減輕CIA小鼠的關節(jié)腫脹和病理學改變

如圖1A 所示，正常組小鼠關節(jié)、足爪和趾均正常，CIA組小鼠關節(jié)（膝、踝和趾關節(jié)）、足爪和趾表現(xiàn)為嚴重腫脹、紅斑和關節(jié)僵硬等癥狀；黃芩苷處理組炎癥狀得到減輕，表現(xiàn)為關節(jié)、足爪和趾的腫脹和紅斑消退。AI積分結(jié)果顯示，與正常組對比，CIA 組小鼠AI 積分顯著升高（P＜0.01）；與CIA 組比較，黃芩苷劑量依賴性降低AI積分（P＜0.05），見圖1C。膝關節(jié)HE染色組織學分析顯示，正常組小鼠關節(jié)未見病理學改變，CIA 組小鼠關節(jié)表現(xiàn)為滑膜增生、炎癥細胞浸潤和骨破壞的現(xiàn)象，黃芩苷處理組顯示關節(jié)病理學改變有減輕，見圖1B；軟骨評分結(jié)果顯示，與正常組對比，CIA 組小鼠軟骨評分顯著升高（P＜0.01）；與CIA 組比較，黃芩苷劑量依賴性降低軟骨評分（P＜0.05），見圖1D。

2 黃芩苷抑制促CIA進展相關因子的生成

ELISA 結(jié)果顯示，與正常組對比，CIA 組血清中IL-1β、TNF-α、總IgG、同種型特異性IgG2a 和IL-17A的水平及關節(jié)組織中IL-17A 的水平均顯著升高（P＜0.01）；與CIA 組比較，黃芩苷以劑量依賴性方式降低上述指標的水平（P＜0.05），見圖2。

Figure 1.Effects of baicalin（Bai）on joint swelling and pathological changes in CIA mice.A:representative images of the hind paws in different groups；B:representative HE staining images of the hind leg knee joints in different groups（scale bar=500 μm）；C:arthritis index（AI）scores in different groups；D:cartilage scores in different groups.Mean±SD. n=8.##P＜0.01 vs normal group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs CIA group.圖1 黃芩苷對CIA小鼠關節(jié)的腫脹程度和病理學改變的影響

3 黃芩苷降低CIA小鼠的Th17細胞比例

流式細胞結(jié)果顯示，與正常組比較，CIA 組脾臟和MLN 中的CD4+IL-17A+T 細胞的比例均顯著升高（P＜0.01）；與CIA 組比較，黃芩苷劑量依賴性降低脾臟和MLN 中CD4+IL-17A+T 細胞的比例（P＜0.05），見圖3。

4 黃芩苷抑制CIA小鼠BLyS的表達

Western blot 結(jié)果顯示，與正常組比較，CIA 組關節(jié)、脾臟和MLN 組織中BLyS 表達顯著增加（P＜0.01）；黃芩苷劑量依賴性降低關節(jié)、脾臟和MLN 組織中BLyS表達（P＜0.05），見圖4。

5 黃芩苷抑制BLyS 誘導的Th17 細胞分化及促炎因子IL-1β和TNF-α的生成

流式細胞結(jié)果顯示，與對照組比較，BLyS 組中CD4+IL-17A+T 細胞的比例顯著升高（P＜0.01）；與BLyS 組比較，BLyS+Bai 組中 CD4+IL-17A+T 細胞的比例顯著降低（P＜0.01），見圖5A。ELISA結(jié)果顯示，與對照組比較，BLyS 組中 IL-1β 和 TNF-α 的水平顯著升高（P＜0.01）；與BLyS 組比較，BLyS+Bai 組中IL-1β和TNF-α的水平顯著降低（P＜0.01），見圖5B。

討 論

目前，盡管對RA 的確切發(fā)病機制尚不清楚，但T 細胞介導的異常免疫反應被認為是關節(jié)發(fā)炎和骨破壞的主要誘因［9］。在CIA 小鼠模型中T 細胞特異性免疫異常反應可導致炎癥細胞浸潤、滑膜增生、軟骨降解和骨侵蝕［10-11］；并伴有非特異性促炎因子（如IL-1β、IL-6 和 TNF-α 等）和自身抗體（IgG 和 IgG2a等）的過量生成，且其過量生成又能進一步激化免疫異常反應和活化炎癥細胞，最終能加劇CIA 的滑膜炎、軟骨損傷和骨吸收［12］。本實驗結(jié)果顯示，黃芩苷可有效減輕CIA 小鼠的關節(jié)腫脹癥狀以及病理學改變，并降低血清中 IL-1β、TNF-α、IgG 和 IgG2a 的水平，提示黃芩苷具有抗RA的作用。

Figure 2.Effects of baicalin（Bai）on inflammatory indexes and immune markers in CIA mice.Meas±SD. n=8，##P＜0.01 vs normal group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs CIA group.圖2 黃芩苷對CIA小鼠的炎癥指標和免疫指標的影響

Th17 細胞在RA 免疫性炎癥啟動過程中發(fā)揮重要作用。在CIA小鼠模型中，Th17細胞分泌的IL-17能募集滑膜炎性巨噬細胞、中性粒細胞和T 細胞沉積于關節(jié)處滑膜并能上調(diào)IL-1β、IL-6 和 TNF-α 等促炎因子分泌，最終加劇滑膜炎、軟骨損傷和骨吸收［8-11］。抑制 IL-17 可緩解 CIA 小鼠關節(jié)病變部分的炎癥反應［13］。因此，抑制Th17 細胞分化可減輕RA的炎癥反應。本實驗結(jié)果顯示，黃芩苷可降低CIA小鼠脾臟和MLN 中Th17細胞比例，并降低血清和關節(jié)處的IL-17A 水平，提示黃芩苷可通過降低Th17 細胞生成來減輕CIA。

Figure 3.Effect of baicalin（Bai）on the the proportion of Th17 cells in spleen（A）and MLN（B）of CIA mice.Meas±SD. n=8.##P＜0.01 vs normal group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs CIA group.圖3 黃芩苷對CIA小鼠Th17細胞比例的影響

本實驗進一步探究了黃芩苷降低Th17 細胞生成的潛在調(diào)控分子機制。研究顯示，BLyS 可通過跨膜激活劑、鈣調(diào)節(jié)劑和親環(huán)蛋白配體相互作用物（transmembrane activator and calcium modulator and cyclophilin ligand interactor，TACI）等受體參與調(diào)節(jié)Th17 細胞分化和 T 細胞介導的免疫炎癥反應［14-15］。BLyS 在包括RA 在內(nèi)的多種自身免疫性疾病患者中高表達，且基因靶向抑制BLyS 可減輕RA 和系統(tǒng)性紅斑狼瘡損傷［16-17］。因此，本實驗進一步檢測黃芩苷對CIA 小鼠中BLyS 表達的影響，結(jié)果顯示，黃芩苷可降低CIA 小鼠病變關節(jié)、脾臟和MLN 中BLyS的表達。另外，本實驗還發(fā)現(xiàn)黃芩苷可降低BLyS 刺激的 CD4+T 細胞群中 Th 細胞的比例、IL-1β 和 TNF-α 水平。這些結(jié)果提示，在CIA 小鼠中，黃芩苷能抑制BLyS 介導的Th17 細胞分化和Th17 細胞介導的免疫反應。

Figure 4.Effect of baicalin（Bai）on the expressions of BLyS in joint，spleen and MLN tissues of CIA mice.Meas±SD. n=8.##P＜0.01 vs normal group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs CIA group.圖4 黃芩苷對CIA小鼠膝關節(jié)、脾臟和MLN中BLyS表達的影響

Figure 5.Baicalin（Bai）inhibits Th17 cell differentiation and the levels of proinflammatory factors IL-1β and TNF-α in CD4+ T cell population induced by BLyS.A:the proportion of CD4+ IL-17A+ T cells in each group was detected by flow cytometry；B:the levels of IL-1β and TNF-α in each group were detected by ELISA.Meas±SD. n=8.##P＜0.01 vs Con group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs BLyS+Bai group.圖5 黃芩苷抑制BLyS誘導的CD4+T細胞群中的Th17細胞分化及促炎因子IL-1β和TNF-α的水平

綜上所述，黃芩苷能通過抑制促炎因子IL-1β、IL-6 和 TNF-α 的生成和 BLyS 介導的 Th17 細胞分化來發(fā)揮抗RA的作用。