于雪嬌 ， 何金玲 ， 楊博文 ， 焦向英 ，2， 曹濟民 ，2， 賀忠梅 ，2， 燕 子 ，2△

（山西醫(yī)科大學(xué) 1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)系，2細(xì)胞生理學(xué)教育部重點實驗室，山西太原030001）

隨著我國城市現(xiàn)代化建設(shè)的高速發(fā)展，交通業(yè)、建筑業(yè)等發(fā)生意外事故造成的創(chuàng)傷患者逐年增多。臨床研究表明，創(chuàng)傷不僅可直接損傷心臟，還可導(dǎo)致繼發(fā)性心臟損傷（trauma-induced secondary cardiac injury，TISCI）［1］。此類患者在創(chuàng)傷后 24 h 內(nèi)無任何心功能指標(biāo)的異常，但在創(chuàng)傷后數(shù)天或數(shù)周出現(xiàn)心功能障礙，病情隱匿，極易漏診，死亡風(fēng)險極高［2］。

已有研究證實，心肌細(xì)胞凋亡是TISCI的主要原因［3］，但其具體機制尚不清楚。本課題組前期研究顯示，在引起創(chuàng)傷大鼠心肌細(xì)胞凋亡的主要途徑中，介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）凋亡途徑的關(guān)鍵分子caspase-12最早被激活。應(yīng)激、缺血、缺氧等多種病理因素刺激可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)失衡，從而引起 ERS［4］。短暫而輕微的 ERS 發(fā)生時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的跨膜傳感器轉(zhuǎn)錄激活因子6（activating transcription factor 6，ATF6）、蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）和需肌醇酶 1α（inositol-requiring enzyme 1α，IRE1α）介導(dǎo)的3 條信號通路相繼被激活，誘導(dǎo)適應(yīng)性反應(yīng)以維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，進而保護細(xì)胞。但若ERS時間延長或加劇時，ERS凋亡途徑被激活，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［5］，進而參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展。本研究應(yīng)用Noble-Collip 創(chuàng)傷儀構(gòu)建機械創(chuàng)傷大鼠模型，通過檢測ERS 及其凋亡途徑的激活情況，探討創(chuàng)傷致大鼠心肌細(xì)胞凋亡的潛在機制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 試劑 Krebs-Henseleit（K-H）液、蛋白酶抑制劑 PMSF、RIPA 裂解液、磷酸酶抑制劑、BCA 蛋白濃度測定試劑盒和SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒（博士德生物工程有限公司）；抗GAPDH 抗體、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG 和HRP 標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；抗葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucoseregulated protein 78，GRP78）、IRE1α、p-IRE1α、C/EBP 同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）、caspase-12 和 caspase-3 抗體（Abcam）；抗 PERK、p-PERK 和 cleaved caspase-3 抗體（Cell Signaling Technology）；抗ATF6 抗體（Santa Cruz）；4-苯基丁酸（4-phenylbutyric acid，4-PBA）購自 Sigma；caspase-3 活性檢測試劑盒（南京碧波生物科技有限公司）。

1.2 動物 清潔級健康雄性SD 大鼠，6～8 周齡，體質(zhì)量180～220 g，由山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供［合格證號為SCXK（晉）2015-0001］。

2 方法

2.1 實驗大鼠的分組及模型的構(gòu)建 將大鼠隨機分為偽創(chuàng)傷（sham）組（n=6）、創(chuàng)傷（trauma）組（創(chuàng)傷后 0 h、3 h、6 h、12 h 和24 h 各時點n=6）和創(chuàng)傷+ERS抑制劑4-PBA 組（n=6）。按照參考文獻(xiàn)［6-7］的方法對大鼠進行腹腔注射麻醉，麻醉成功后置于直徑30 cm的Noble-Collip 創(chuàng)傷儀中，創(chuàng)傷儀以40 r/min 的速率運行5 min，共200 r。偽創(chuàng)傷組大鼠被膠帶固定于創(chuàng)傷儀內(nèi)，在轉(zhuǎn)動過程中不會跌落造成損傷；創(chuàng)傷組和創(chuàng)傷+4-PBA 組大鼠每轉(zhuǎn)動1 圈跌落1 次，進而造成創(chuàng)傷；創(chuàng)傷+4-PBA 組大鼠在創(chuàng)傷后即刻腹腔注射4-PBA（100 mg/kg）。

2.2 大鼠離體心功能檢測 大鼠麻醉后，迅速開胸取心臟，放入預(yù)冷的K-H 液中，迅速修剪后將主動脈固定到Langendorff 灌流裝置上，以K-H 液行主動脈逆行灌流，保證恒壓100 cmH2O，恒溫37℃，并充以95%氧氣和5%二氧化碳混合氣體。待心臟穩(wěn)定跳動后，將帶球囊的心導(dǎo)管經(jīng)過房室瓣置于左心室內(nèi)，球囊內(nèi)充有灌流液，使左心室舒張末壓維持在10 mmHg。球囊導(dǎo)管另一端與壓力換能器相連，待各項心功能指標(biāo)穩(wěn)定后對左室內(nèi)壓進行采集。采用BL-410生物信號記錄分析系統(tǒng)記錄大鼠±dp/dtmax數(shù)據(jù)。

2.3 大鼠心肌組織樣品的制備 偽創(chuàng)傷組大鼠經(jīng)創(chuàng)傷儀運轉(zhuǎn)5 min 后處死；創(chuàng)傷組大鼠按照創(chuàng)傷后不同時點依次處死；創(chuàng)傷+4-PBA 組大鼠在ERS 標(biāo)志物表達(dá)最高的時點即創(chuàng)傷后6 h處死。處死大鼠后，開胸，取心臟，于4℃磷酸鹽緩沖液中洗去殘余血液，冰上取心尖組織，剪碎，裂解，提取蛋白用于后續(xù)實驗。

2.4 Western blot 制膠，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，孵育I抗（GRP78抗體按1∶2 500稀釋，PERK、p-PERK、IRE1α、p-IRE1α 和 caspase-12 抗體按 1∶1 000 稀釋，ATF6、CHOP 和caspase-3 抗體按1∶500 稀釋），4℃過夜；用洗滌緩沖液洗膜3 次，每次10 min，孵育II 抗2 h（HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG和HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠 IgG 按1∶2 000 稀釋）；洗膜，用UVP 凝膠成像系統(tǒng)曝光。以目的蛋白灰度值與內(nèi)參照GAPDH 灰度值的比值反映蛋白表達(dá)水平。

2.5 caspase-3 活性檢測 取各組心肌組織，裂解，測定蛋白濃度，根據(jù)分組在96 孔酶標(biāo)板上設(shè)置空白對照孔和樣品孔；按照說明書依次加入樣品裂解液、反應(yīng)緩沖液和底物。催化底物Ac-DEVD-pNA（acetyl-Asp-Glu-Val-Aspp-nitroanilide）被 caspase-3 剪切后，會產(chǎn)生黃色的pNA，用酶標(biāo)儀測定的吸光度（A）可反映caspase-3的活性。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

用GraphPad Prism 7.0 軟件統(tǒng)計并作圖。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。組間均數(shù)比較用單因素方差分析及LSD-t檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 創(chuàng)傷導(dǎo)致大鼠離體心功能降低，心肌組織凋亡執(zhí)行蛋白caspase-3活性增強

與偽創(chuàng)傷組相比，創(chuàng)傷組大鼠24 h 內(nèi)各時點（0、3、6、12 和 24 h）心電圖、平均動脈壓及在體心功能（包括±dp/dtmax）均未出現(xiàn)顯著異常，心臟、肝臟、腎臟和腸管均未出現(xiàn)顯著出血，僅觀察到肝臟和腸管輕度充血，且創(chuàng)傷大鼠通常在創(chuàng)傷后1～3 h 蘇醒，24 h內(nèi)生存率100%。但離體心功能指標(biāo)±dp/dtmax均在創(chuàng)傷后24 h顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），見表1。

表1 創(chuàng)傷24 h內(nèi)大鼠離體心功能指標(biāo)±dp/dtmax的變化Table 1.Changes of ex vivo cardiac function indexes±dp/dtmax in rats within 24 h of trauma（mmHg/s.Mean±SD. n=6）

與偽創(chuàng)傷組相比，創(chuàng)傷組大鼠心肌組織中凋亡執(zhí)行蛋白caspase-3 活性形式（cleaved caspase-3）在創(chuàng)傷后6 h 顯著增加（P＜0.05），12 h 達(dá)到最高峰（P＜0.01），見圖1A；caspase-3 活性檢測試劑盒的結(jié)果同樣顯示，caspase-3 活性在創(chuàng)傷后6 h 顯著升高（P＜0.01），12 h達(dá)到最高水平（P＜0.01），見圖1B。

Figure 1.The expression and activity of apoptotic execution protein caspase-3 in rat myocardial tissues at different time points after trauma.A:the protein levels of caspase-3 and cleaved caspase-3 detected by Western blot；B:activity of caspase-3 determined by commercially available kit.Mean±SD. n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs sham group.圖1 創(chuàng)傷后不同時點凋亡執(zhí)行蛋白caspase-3在大鼠心肌組織中的表達(dá)和活性

2 創(chuàng)傷誘導(dǎo)大鼠心肌組織ERS 標(biāo)志分子GRP78、ATF6、p-PERK和p-IRE1α水平升高

與偽創(chuàng)傷組相比，創(chuàng)傷組大鼠心肌組織GRP78蛋白表達(dá)在創(chuàng)傷后3 h開始顯著增加（P＜0.05），在創(chuàng)傷后6 h 達(dá)到最高水平（P＜0.01），見圖2A；ATF6 蛋白表達(dá)在創(chuàng)傷后6 h 開始增加（P＜0.05），12 h 達(dá)到最高水平（P＜0.01），見圖2B；PERK和IRE1α表達(dá)在創(chuàng)傷后無顯著變化（P＞0.05），但磷酸化水平在創(chuàng)傷后3 h 顯著升高（P＜0.05），6 h 達(dá)到最高（P＜0.01），見圖2C、D。

3 創(chuàng)傷導(dǎo)致大鼠心肌組織ERS 相關(guān)凋亡蛋白CHOP表達(dá)升高及caspase-12活化

與偽創(chuàng)傷組相比，創(chuàng)傷組大鼠心肌組織CHOP表達(dá)在創(chuàng)傷后6 h 顯著增加（P＜0.05），12 h 達(dá)到最高水平（P＜0.01），見圖3A；caspase-12 活性形式（cleaved caspase-12）在創(chuàng)傷后 3 h 水平升高（P＜0.05），6 h達(dá)到高峰（P＜0.01），見圖3B。

4 抑制ERS 可降低創(chuàng)傷大鼠心肌組織CHOP 表達(dá)并抑制caspase-12活化

與創(chuàng)傷組相比，給予ERS 抑制劑4-PBA 后，創(chuàng)傷大鼠心肌組織CHOP 和cleaved caspase-12 蛋白水平顯著降低（P＜0.05），見圖4。

Figure 2.The expression and phosphorylation levels of ERS marker molecules GRP78，ATF6，PERK and IRE1α in rat myocardial tissues at different time points after trauma.A:GRP78 protein expression level；B:ATF6 protein expression level；C:PERK protein expression and phosphorylation levels；D:IRE1α protein expression and phosphorylation levels.Mean±SD.n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs sham group.圖2 創(chuàng)傷后不同時點ERS標(biāo)志分子GRP78、ATF6、PERK和IRE1α在大鼠心肌組織中的表達(dá)和磷酸化水平

5 抑制ERS可減少創(chuàng)傷大鼠心肌組織caspase-3活化

與創(chuàng)傷組相比，給予4-PBA 干預(yù)后創(chuàng)傷大鼠心肌組織中cleaved caspase-3 蛋白水平顯著降低（P＜0.05），見圖5A；采用caspase-3 活性檢測試劑盒對心肌組織caspase-3 活性進行測定，結(jié)果同樣顯示，4-PBA 干預(yù)后創(chuàng)傷大鼠心肌組織caspase-3活性顯著下調(diào)（P＜0.05），見圖5B。

討 論

TISCI 是一種隱匿性疾病，常因貽誤治療時機導(dǎo)致患者死亡［8］，而其具體發(fā)病機制尚不清楚。已有的研究表明，在創(chuàng)傷動物模型中，創(chuàng)傷可導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡，進而引起心功能降低及隨后的繼發(fā)性心臟損傷［6，9］。引起細(xì)胞凋亡通常有 3 條途徑:死亡受體途徑、線粒體途徑和ERS 途徑［10］。在前期研究中，本課題組對介導(dǎo)3 條凋亡途徑的標(biāo)志性蛋白caspase-8、caspase-9和caspase-12分別進行了活性檢測，顯示介導(dǎo) ERS 凋亡途徑的 caspase-12 最早被激活［7］。為了探討創(chuàng)傷是否通過激活ERS 進而導(dǎo)致大鼠心肌細(xì)胞凋亡，本研究首先根據(jù)參考文獻(xiàn)［6］和課題組既往研究成功復(fù)制造成繼發(fā)性心臟損傷的創(chuàng)傷大鼠模型［7，11-12］，并對創(chuàng)傷大鼠心肌組織凋亡的發(fā)生進行驗證，結(jié)果顯示凋亡執(zhí)行蛋白caspase-3被活化，證實創(chuàng)傷可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。

為了觀察創(chuàng)傷后ERS 的發(fā)生情況，我們對ERS標(biāo)志分子進行檢測。GRP78 是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶蛋白，通常以其表達(dá)增高作為 ERS 發(fā)生的標(biāo)志［13］；而ATF6、IRE1α 和 PERK 是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白，是 ERS 的傳感器，過度 ERS 時，GRP78 與 ATF6、IRE1α 和 PERK解離，進而激活這3 個傳感器［14］。本研究結(jié)果表明，創(chuàng)傷導(dǎo)致 GRP78 的解離及 ATF6、IRE1α 和 PERK 的激活，引起ERS 的發(fā)生。為了進一步探討創(chuàng)傷是否激活ERS凋亡途徑，我們對ERS凋亡相關(guān)蛋白CHOP及caspase-12 進行檢測。CHOP 由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白PERK 和 ATF6 共同激發(fā)［15-16］；caspase-12 的活化是由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白IRE1α 磷酸化觸發(fā)的［14］。本研究結(jié)果顯示，CHOP 及caspase-12在創(chuàng)傷后表達(dá)水平顯著上調(diào)，推測創(chuàng)傷引起的大鼠心肌細(xì)胞凋亡可能與ERS凋亡途徑的激活有關(guān)。

Figure 3.The expression and activation levels of ERS-related apoptosis proteins CHOP and caspase-12 in rat myocardial tissues at different time points after trauma.A:CHOP protein expression level；B:caspase-12 and cleaved caspase-12 protein levels.Mean±SD. n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs sham group.圖3 創(chuàng)傷后不同時點ERS相關(guān)凋亡蛋白CHOP和caspase-12在大鼠心肌組織中的表達(dá)和活性水平

Figure 4.The effects of ERS inhibitor 4-PBA treatment on the expression and activation of ERS-related apoptosis proteins CHOP and caspase-12 in traumatic rats.A:CHOP protein expression level；B:caspase-12 and cleaved caspase-12 protein levels.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs trauma group.圖4 ERS抑制劑4-PBA處理對ERS相關(guān)凋亡蛋白CHOP表達(dá)和caspase-12活化的影響

Figure 5.The effects of ERS inhibitor 4-PBA treatment on the activation of caspase-3 in traumatic rats.A:caspase-3 and cleaved caspase-3 protein levels detected by Western blot；B:activity of caspase-3 determined by commercially available kit.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs trauma group.圖5 ERS抑制劑4-PBA處理對創(chuàng)傷大鼠心肌組織caspase-3活化的影響

為了進一步明確ERS 凋亡途徑的激活對創(chuàng)傷致大鼠心肌細(xì)胞凋亡的作用，我們給予創(chuàng)傷大鼠ERS抑制劑 4-PBA 處理［17］，結(jié)果顯示，抑制 ERS 可降低ERS 相關(guān)凋亡蛋白 CHOP 和 caspase-12 的表達(dá)，阻斷ERS 凋亡途徑；也可下調(diào)凋亡執(zhí)行蛋白caspase-3 的活性。以上結(jié)果證實創(chuàng)傷引起的大鼠心肌細(xì)胞凋亡是ERS凋亡途徑激活所致。

綜上所述，本研究顯示創(chuàng)傷早期可誘發(fā)大鼠心肌組織ERS的產(chǎn)生，進而激活ERS凋亡通路，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。這為TISCI 的發(fā)病機制提供了新的實驗依據(jù)。