李少麗，鄧建朝，李春生，楊賢慶，吳燕燕，陳勝軍，馬海霞

1(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州，510300) 2(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306)

大眼金槍魚(Thunnusobesus) 又稱肥壯金槍魚，屬鱸形目鯖科，大洋性洄游魚類，分布于印度洋、大西洋、太平洋和南海外海等地[1]。其肉質(zhì)鮮美，營養(yǎng)豐富，不僅富含蛋白質(zhì)，還含有DHA和EPA等不飽和脂肪酸，食用和商用價(jià)值極高[2-4]。據(jù)最新國際漁業(yè)動態(tài)報(bào)道，隨著金槍魚市場價(jià)格不斷走高，捕撈量也在大幅提高[5]。

目前，國內(nèi)市售大眼金槍魚占有市場比例較高，由于其屬于紅肉魚類，在加工和流通過程當(dāng)中，如果加工和貯藏不當(dāng)，容易造成生物胺超標(biāo)。生物胺是一種低分子量的堿性含氮化合物，廣泛存在于蛋白質(zhì)及氨基酸含量豐富的水產(chǎn)品中，主要通過微生物產(chǎn)生的氨基酸脫羧酶分解游離氨基酸產(chǎn)生[6-8]。食用生物胺超標(biāo)水產(chǎn)品，易引起人體中毒，近些年來因食用金槍魚而發(fā)生的生物胺中毒事件時有發(fā)生。國內(nèi)對于生食金槍魚已經(jīng)有了相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，其中組胺不得超過90 mg/kg[9-11]。

國內(nèi)外對水產(chǎn)品中生物胺產(chǎn)生菌已經(jīng)有了相關(guān)研究，常見的有弧菌屬、假單胞菌屬、葡萄球菌屬、乳酸菌、腸桿菌等[12-13]，除此之外一些新的菌群也被證實(shí)可產(chǎn)生生物胺，如沙門菌群、巴斯德菌和根瘤菌等不同菌科[14]。目前，大眼金槍魚中生物胺產(chǎn)生菌的相關(guān)研究鮮有報(bào)道。本文將大眼金槍魚的生魚片作為研究對象，通過微生物分離結(jié)合高效液相色譜技術(shù)，篩選出了生物胺產(chǎn)生菌，再利用表型特征鑒定和基因型鑒定相結(jié)合的方法[15-16]，確定了菌株的種類，以期為生食大眼金槍魚肉中生物胺的控制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大眼金槍魚，購于廣州市沛洋食品有限公司(-60 ℃凍藏)。

腐胺、尸胺、精胺、亞精胺、色胺、苯乙胺、組胺、酪胺、丹磺酰氯(純度≥98%)，美國Sigma公司；NaCl、NaOH、NaHCO3、NH3·H2O，廣州粵升化學(xué)試劑廠；胰蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂、L-組氨酸、色氨酸、酪氨酸、胰蛋白胨大豆瓊脂(tryptose soya agar，TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(tryptic soy broth，TSB)，廣州市普博儀器有限公司；乙睛(色譜純)，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；超純水，實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20AD高效液相色譜儀，日本島津SHINADZU公司；CX41顯微鏡，日本OLYMPUS公司；MILLI-Q超純水機(jī)，美國Millipore公司；3K30高速冷凍離心機(jī)，德國 SIGMA公司；SPX-500智能生化培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠；LDZX-75KBS型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；TU-1990紫外-可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；VITEK 2 COMPACT細(xì)菌鑒定及藥敏測試儀，法國梅里埃公司；DYY-7B電泳儀，北京六一儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備

將金槍魚在無菌環(huán)境下解凍后置于0 ℃下貯藏備用。

1.3.2 菌落總數(shù)和K值的測定

參考GB4789.2—2016的方法[17]，測定0 ℃貯藏的大眼金槍魚中的菌落總數(shù)。

參考SC/T 3048—2014[18]的方法，測定0 ℃貯藏的大眼金槍魚中K值變化。K值計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：ATP為腺苷三磷酸濃度、ADP為腺苷二磷酸濃度、AMP為腺苷酸濃度、IMP為肌苷酸濃度、HxR為次黃嘌呤核苷濃度、Hx為次黃嘌呤濃度，單位均為μmol/g。

1.3.3 培養(yǎng)基配制

參考朱曉娟[19]和郝淑賢等[20]的方法配制如下培養(yǎng)基。

生物胺篩選培養(yǎng)基(g/L)： 胰蛋白胨5.0、酵母浸粉5.0、NaCl 5.0、CaCO31.0、瓊脂20、溴甲酚紫0.06、L-組氨酸2、色氨酸2、酪氨酸2，1 mol/L HCl調(diào)pH至5.3±0.2。

TSA培養(yǎng)基(g/L)：取47 g TSA于1 L蒸餾水中滅菌，制成平板培養(yǎng)基和斜面培養(yǎng)基。

TSB培養(yǎng)基：取TSB 3 g、L-組氨酸0.03 g、色氨酸0.03 g、酪氨酸0.03 g于100 mL蒸餾水中滅菌。

1.3.4 菌株的分離純化

參考吳燕燕等[21]的方法，無菌條件下取0 ℃貯藏12 d的5 g魚肉于45 mL無菌生理鹽水中，制備為10-1樣液，依次梯度稀釋到10-2、10-3、10-4和10-5后，各取100 μL菌液涂布到生物胺初篩培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)3 d。

挑取藍(lán)紫色菌落在TSA培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)至出現(xiàn)單菌落，30 ℃培養(yǎng)3 d。

將單菌落劃線接種于TSA斜面培養(yǎng)基上富集培養(yǎng)，并于菌種保藏箱中臨時保藏。

1.3.5 生長曲線的測定

參考AYYASH等[22]的方法，將分離純化的菌落接種于TSB培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)，每間隔相同時間用紫外分光光度計(jì)連續(xù)測定培養(yǎng)液的OD605nm值，觀察菌株的生長情況。

1.3.6 生物胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定

參考趙慶志等[23]的衍生方法略有改動，將單菌落接種于TSB培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)，30 ℃培養(yǎng)3 d，各取1 mL活化菌液離心，取上清液，對上清液進(jìn)行衍生處理。

色譜條件參考GB5009.208—2016[24]的方法。色譜柱：WondaCract ODS-2色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱溫40 ℃，流速0.8 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，檢測波長 254 nm。流動相A為含1%甲酸的0.01 mol/L 乙酸銨溶液，流動相B為乙腈，梯度洗脫程序?yàn)椋?～22 min，B=58%(體積分?jǐn)?shù))；22～25 min，B=78%(體積分?jǐn)?shù))；25～32.01 min，B=90%(體積分?jǐn)?shù))；32.01～37 min，B=58%(體積分?jǐn)?shù))，外標(biāo)法定量。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程如表1所示。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程Table 1 Regression equations of standard curves

1.3.7 形態(tài)學(xué)指標(biāo)

觀察并記錄TSA上單菌落形態(tài)特征，挑取單菌落進(jìn)行涂片、革蘭氏染色，于顯微鏡下觀察并記錄其大小、顏色、形狀、排列等。

1.3.8 菌種鑒定

1.3.8.1 生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定

吸取適量的菌液分別與3 mL 0.45%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)) NaCl生理鹽水混勻，配制相當(dāng)于0.50～0.63麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙?，使用VITEK 2全自動微生物分析系統(tǒng)進(jìn)行菌種鑒定[25]。

1.3.8.2 產(chǎn)生物胺細(xì)菌的16S rDNA 鑒定

篩選出產(chǎn)胺量最高的菌株進(jìn)行DNA提取，將 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析，送與測序公司進(jìn)行測序，將返回的序列進(jìn)行比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落總數(shù)和K值測定結(jié)果

將大眼金槍魚生魚片置于0 ℃下貯藏，結(jié)果如圖1所示。魚肉中菌落總數(shù)的變化情況由圖1-a可知，大眼金槍魚初始菌落總數(shù)為2.46 lgCFU/g，菌落總數(shù)初期生長緩慢，第4天達(dá)到4.45 lgCFU/g，超過生食金槍魚SC/T 3117—2006規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)[10]，第12天時菌落總數(shù)為7.13 lgCFU/g，之后菌落長勢趨于平緩。K值是反映水產(chǎn)品鮮度的一個重要指標(biāo)，可以明確表明魚肉的新鮮程度。一般認(rèn)為，K值低于20%為一級鮮度，20%～40%為二級鮮度，大于70%已為腐敗[26]。由圖1-b可知，魚肉初始K值為12.1%，第4天超過20%，不能用于制作生魚片[27]，K值增長速度為3.30%/d。為更加準(zhǔn)確分離出生物胺產(chǎn)生菌，該實(shí)驗(yàn)選擇菌落總數(shù)達(dá)到相對穩(wěn)定階段12 d的魚肉作為實(shí)驗(yàn)樣品。

a-0 ℃下菌落總數(shù)的變化;b-0 ℃下K值的變化圖1 0 ℃下菌落總數(shù)和K值變化Fig.1 Change of colony count aerobic plate count and Kvalue at 0 ℃

2.2 生物胺產(chǎn)生菌的分離純化

典型的產(chǎn)胺菌在生物胺篩選培養(yǎng)基中顯示藍(lán)紫色，其原理是微生物利用培養(yǎng)基中的游離氨基酸生成了堿性生物胺，從而使菌落周圍環(huán)境的pH值上升，溴甲酚紫指示劑顯示為藍(lán)紫色[28]。挑取藍(lán)紫色菌落劃線接種于TSA培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)，最終得到9株單菌落，編號為B-1～B-9。

2.3 生物胺產(chǎn)生菌的生長曲線

將9株生物胺產(chǎn)生菌分別接種于TSB培養(yǎng)基中，確定9株細(xì)菌在0和30 ℃條件下的生長曲線，結(jié)果如圖2所示。9株菌株在0 ℃下生長緩慢，48 h后進(jìn)入生長穩(wěn)定期。而在30 ℃下培養(yǎng)9株菌，對數(shù)生長期為4～12 h，之后進(jìn)入生長穩(wěn)定期。結(jié)果表明，從大眼金槍魚中分離得到的9株菌株適宜在較高溫度下生長，初步鑒定為嗜溫菌(25～40 ℃)[29]。

2.4 生物胺生成情況分析

為進(jìn)一步確認(rèn)這9株菌的產(chǎn)胺能力，將9株菌株分別接種到TSB培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)3 d，分析培養(yǎng)液中生物胺產(chǎn)生質(zhì)量濃度，結(jié)果如表2所示。由表2可知，9株菌均可產(chǎn)生色胺、腐胺和尸胺，菌株B-9生物胺生成能力較其他菌株最弱，總質(zhì)量濃度為2.78 mg/L。B-1、B-3和B-7的產(chǎn)胺能力較強(qiáng)，總生物胺質(zhì)量濃度分別為40.4、41.3和50.3 mg/L。其中B-1的色胺產(chǎn)生質(zhì)量濃度最高，為38.9 mg/L； B-3亞精胺產(chǎn)生質(zhì)量濃度最高，為31.2 mg/L；B-7酪胺產(chǎn)生質(zhì)量濃度最高，為38.5 mg/L。

表2 菌株的生物胺生成情況Table 2 Biogenic amine contents produced by strains

a-9株菌株在0 ℃下的生長曲線;b-9株菌株在30 ℃下的生長曲線圖2 九株菌株在0 ℃和30 ℃下的生長曲線Fig.2 Growth curves of nine strains at 0 ℃ and 30 ℃

2.5 生物胺產(chǎn)生菌的形態(tài)特征

將3株產(chǎn)胺量最高的菌株進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察。從顯微鏡下觀察到B-1為革蘭氏陰性菌，菌落形態(tài)為乳黃色圓形凸起菌落，邊緣整齊，菌株為球狀菌，無芽孢。B-3為革蘭氏陰性菌，菌落形態(tài)為圓形，表面光滑不透明，乳黃色，邊緣整齊，菌株為桿狀菌，無芽孢。B-7為革蘭氏陽性菌，菌落形態(tài)為白色凸起，邊緣整齊，表面光滑圓潤，菌株為球狀菌，無芽孢。

2.6 生物胺產(chǎn)生菌的鑒定

2.6.1 生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定

VITEK 2鑒菌儀是通過將檢測菌株的各項(xiàng)生理生化實(shí)驗(yàn)反應(yīng)結(jié)果與已知的菌株數(shù)據(jù)庫作比較，從而推測菌株的可能性概率，可信概率范圍為85.0%～99.0%。經(jīng)鑒定，3株菌株的生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。鑒定B-1菌株為巨型球菌(Macrococcuscaseolyticus)，可信概率為99.0%；B-3菌株為產(chǎn)堿普羅威登斯菌(Providenciaalcalifaciens)，可信概率為97.0%；B-7菌株為糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)，可信概率為99.0%。

表3 菌株鑒定結(jié)果Table 3 Identification of strain

2.6.2 16S rDNA 鑒定

瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物圖片結(jié)果如圖3所示，電泳可成功擴(kuò)增出預(yù)期的DNA片段，且2 000 bp處擴(kuò)增條帶清晰明亮，所以該P(yáng)CR片段可同時作為后續(xù)PCR反應(yīng)中的引物和模板，送檢測序。

圖3 三株菌株的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis of three strains

將測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，并建立系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果如圖4所示。從比對結(jié)果可知，樣本B-1與溶酪巨型球菌(Macrococcuscaseolyticus)親源關(guān)系最近，樣本B-3與產(chǎn)堿普羅威登斯菌(Providenciaalcalifaciens)親源關(guān)系最近，樣本B-7與糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)親源關(guān)系最近。由于溶酪巨型球菌(Macrococcuscaseolyticus) 為細(xì)菌致病菌，可引起一些水產(chǎn)動物大量死亡，推斷B-1來自外界環(huán)境，并隨著貯藏時間的增加，逐漸成為金槍魚腐敗菌中的優(yōu)勢菌種[30]。產(chǎn)堿普羅威登斯菌(Providenciaalcalifaciens)和糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)是人和動物腸道的正常菌群[31-32]，但由于金槍魚體型較大，腸道污染可能性較小，因此推斷B-3與B-7同樣來自外界環(huán)境。

圖4 基于16S rDNA 序列構(gòu)建的進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic trees based on the 16S rDNA sequences

3 結(jié)論

本研究利用生物胺初篩培養(yǎng)基結(jié)合高效液相色譜技術(shù)，從大眼金槍魚生魚片中篩選出9株生物胺產(chǎn)生菌，其中3株產(chǎn)胺量最高的菌株分別為溶酪巨型球菌 (Macrococcuscaseolyticus)、產(chǎn)堿普羅威登斯菌(Providenciaalcalifaciens)和糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)。溶酪巨型球菌(Macrococcuscaseolyticus)和產(chǎn)堿普羅威登斯菌(Providenciaalcalifaciens)均屬于新發(fā)現(xiàn)的生物胺產(chǎn)生菌。糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)曾被LADERO等[33]從乳制品中分離得到。產(chǎn)堿普羅威登斯菌(Providenciaalcalifaciens)能夠引起人體食物中毒、嚴(yán)重的腸胃炎、腹瀉等疾病，對人體健康有潛在的危險(xiǎn)性[31]。

研究表明，根據(jù)產(chǎn)胺菌的生物學(xué)特性，可通過抑制相關(guān)菌群和低溫貯藏相結(jié)合的方法來控制生物胺的生成，保證大眼金槍魚的品質(zhì)和食用安全性。