張賽蘭，李婷，程中一，周麗，周哲敏，劉中美，崔文璟

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

酰胺類物質(zhì)廣泛應(yīng)用于工業(yè)各個行業(yè)，其中丙烯酰胺及其聚合物主要應(yīng)用于凝結(jié)劑、土壤改良劑及石油回收劑等行業(yè)，煙酰胺是VB族中的一員，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥，化妝品及食品等行業(yè)，具有重要的經(jīng)濟(jì)價值。目前，生物法生產(chǎn)酰胺類化合物正逐漸取代傳統(tǒng)的化學(xué)合成法，相比較化學(xué)合成法，生物法具有經(jīng)濟(jì)、高效、綠色及副產(chǎn)物少等優(yōu)點(diǎn)。

腈水合酶(nitrile hydratase，NHase，EC 4.2.1.84)是一類能夠水合腈類物質(zhì)生成酰胺類化合物的金屬酶，根據(jù)其活性中心螯合的金屬不同，可將腈水合酶分為鐵型腈水合酶(Fe-NHase)[1]和鈷型腈水合酶(Co-NHase)[2]。腈水合酶主要來源于棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、紅球菌(Rhodococcus)及假諾卡氏菌屬(Nocardia)等原核生物，在植物病原菌和放線菌中也有發(fā)現(xiàn)[3]，真核生物鄰鞭毛蟲(Monosigabrevicollis)中腈水合酶的發(fā)現(xiàn)[4-5]，對NHase研究具有重要意義。最近，在基因庫中很多嗜熱菌來源的腈水合酶基因被注釋卻未被解析，新基因的挖掘?qū)ρ芯侩嫠厦妇哂兄匾饬x。

腈水合酶的熱穩(wěn)定性普遍較差，大部分腈水合酶在50 ℃下就喪失活性[6]。應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的紅球菌R.rhodochrousJ1來源的腈水合酶有2種：高分子量腈水合酶H-NHase和低分子量腈水合酶L-NHase，在催化丙烯腈過程中起主要作用的H-NHase在50 ℃處理10 min僅剩40%酶活[7]，所以在工業(yè)催化過程中，需要通過嚴(yán)格的控溫來維持腈水合酶酶活，增加了能耗。提高腈水合酶的熱穩(wěn)定性，增加酶或菌體在催化過程中的重復(fù)利用率，一直是腈水合酶研究的熱點(diǎn)。2015年，房月芹等通過計算機(jī)半理性設(shè)計，將熱穩(wěn)定性較好的來源于PseudonocardiathermophilaJCM3095的腈水合酶與來源于PsedomonasputidaNRRL-18668腈水合酶的β亞基通過同源片段交換，提高了目標(biāo)蛋白的熱穩(wěn)定性[6]。2015年，XIA等利用一段短肽將P.putidaNRRL-18668腈水合酶的β亞基和α亞基進(jìn)行融合，提高了其酶活和熱穩(wěn)定性[8]。2016年，張曉歡將工業(yè)應(yīng)用菌株R.rhodochrousJ1中H-NHase的β和α融合，提高了其熱穩(wěn)定性[7]。2017年，XIA等根據(jù)自由能進(jìn)行半理性設(shè)計對來源于P.putidaNRRL-18668的融合型腈水合酶進(jìn)行點(diǎn)突變，進(jìn)一步提高腈水合酶的熱穩(wěn)定性[9]。PEI等發(fā)現(xiàn)在AurantimonasmanganoxydansATCC BAA-1229腈水合酶的β亞基表面的一段α螺旋對熱穩(wěn)定性具有重要作用[10]。一方面，研究者們通過蛋白質(zhì)工程技術(shù)，對已有的腈水合酶熱穩(wěn)定性進(jìn)行了成功的改造；另一方面，在基因庫中許多耐熱菌及古菌來源的腈水合酶被注釋，新型耐熱腈水合酶的挖掘?qū)I(yè)應(yīng)用及科學(xué)研究具有重要意義。

在工業(yè)生產(chǎn)中，第3代丙烯酰胺生產(chǎn)菌株R.rhodochrousJ1發(fā)酵周期為100 h[11]，效率低下，且菌株中的酰胺酶會進(jìn)一步將酰胺物質(zhì)催化生成酸，導(dǎo)致產(chǎn)品純度不高。目前，腈水合酶的異源表達(dá)已被廣泛研究[12-13]，該酶已成功在畢赤酵母、大腸桿菌、紅球菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)[14-17]。工業(yè)菌株R.rhodochrousJ1的H-NHase和L-NHase，通過優(yōu)化各亞基之間的SD序列，已成功在大腸桿菌中表達(dá)[18-19]。有研究已成功異源表達(dá)腈水合酶生產(chǎn)煙酰胺，最終產(chǎn)量為230 g/L[20]。王哲通過優(yōu)化全細(xì)胞催化工藝，在分批添加底物的催化下，煙酰胺最終產(chǎn)量為390 g/L[21]。

本研究針對提高腈水合酶的熱穩(wěn)定性，在Genebank基因庫中尋找到一種耐熱菌CaldalkalibacillusthermarumTA2.A1來源的腈水合酶基因，成功實(shí)現(xiàn)該腈水合酶的異源表達(dá)，通過在β亞基的C端添加strep標(biāo)簽成功純化出該酶，研究其熱穩(wěn)定性，對其全細(xì)胞催化工藝優(yōu)化，探尋其工業(yè)應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌DH5α感受態(tài)、大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)，通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司；質(zhì)粒pET-24a(+),由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 主要試劑

3-氰基吡啶和煙酰胺、脫硫生物素，Sigma公司；異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG)和卡那霉素，上海生工生物工程有限公司；基因和引物由蘇州金唯智合成，本文所用引物和序列如表1所示；胰蛋白胨、酵母膏提取物，Oxoid公司；限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和EcoRⅠ，寶生物公司(大連)有限公司(Takara)。

表1 本文所用引物及其序列Table 1 Primers used in this study

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 生物信息分析

利用NCBI-blast工具，將來源于耐熱菌株的腈水合酶(NHase)進(jìn)行初篩，調(diào)查研究背景；利用DNAMAN比對酶活中心的氨基酸序列，對所選基因進(jìn)行復(fù)篩；利用SWISS-MODEL對所選酶進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)分析。最終選擇來源于溫泉熱堿芽孢桿菌CaldalkalibacillusthermarumTA2.A1的腈水合酶(Cal.tNHase)進(jìn)行研究。

1.2.2 表達(dá)載體pET-24a(+)-Cal.tNHase 的構(gòu)建及表達(dá)條件優(yōu)化

將來源于溫泉熱堿芽孢桿菌的腈水合酶(Cal.tNHase)進(jìn)行密碼子優(yōu)化，各亞基前面添加一段優(yōu)化過的RBS序列(AAGGAGATATAGAT)以利于各亞基的表達(dá)[22]。將優(yōu)化過的密碼子序列送至蘇州金唯智進(jìn)行基因合成，連接的載體選擇pET-24a(+)，選擇的基因插入位置為NdeⅠ和EcoRⅠ2個酶切位點(diǎn)，保藏菌株選擇E.coliDH5α。

將合成好的質(zhì)粒pET-24a(+)-Cal.tNHase 轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(DE 3)，涂布在含有50 μg/mL卡那霉素的固體LB平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)過夜，挑取單菌落置于含有50 μg/mL卡那霉素的5 mL 2YT液體培養(yǎng)基的試管中，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)8～10 h。將培養(yǎng)好的試管種子液以1%的接種量轉(zhuǎn)接到含有50 μg/mL卡那霉素的2YT培養(yǎng)基搖瓶中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600=0.6～0.8時，添加不同終濃度為0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L IPTG、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 g/L Co2+的誘導(dǎo)劑，30 ℃，200 r/min誘導(dǎo)14 h，破碎上清通過聚丙稀酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyaclamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分析蛋白表達(dá)情況。

1.2.3Cal.tNHase的分離純化及濃度檢測

分別在β亞基的N端和C端添加strep標(biāo)簽,構(gòu)建pET-24a(+)-sBA和pET-24a(+)-BsA表達(dá)載體，構(gòu)建方法為以質(zhì)粒pET-24a(+)-Cal.tNHase為模板，用表1的引物進(jìn)行全質(zhì)粒PCR，DpnⅠ消化質(zhì)粒模板后，將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coliDH5α，送測序，將測序結(jié)果正確的質(zhì)粒重新轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE 3)，用上述培養(yǎng)方法進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。

收集菌體，用緩沖溶液binding buffer(20 mmol/L Na2HPO4、280 mmol/L NaCl、6 mmol/L KCl，pH=7.4)濃縮5倍重懸浮后，置于冰盒中(冰水混合物)，用超聲破碎儀開3 s停7 s破碎20 min，4 ℃、12 000 r/min、離心1 h，過0.22 μm膜后，strep親和層析進(jìn)行純化。先用抽濾過0.22 μm膜的去離子水將柱子中保存的乙醇溶液至少以5倍體積沖洗干凈；再以1 mL/min的流速，用binding buffer溶液平衡柱子；蛋白樣品始終放在冰上，10 mL過柱子，流速為1 mL/min，再以binding buffer平衡柱子；待紫外吸收降到0后，用washing buffer (20 mmol/L Na2HPO4、280 mmol/L NaCl、6 mmol/L KCl、2.5 mmol/L脫硫生物素，pH=7.4)洗脫，收集蛋白。將收集到的蛋白用Brandford法測定蛋白質(zhì)量濃度，SDS-PAGE分析測定，將蛋白稀釋到0.5 mg/mL備用。

1.2.4Cal.tNHase 水合活性的測定

單位酶活力定義為在30 ℃下1 min催化煙腈生成1 μmol煙酰胺所需要的酶量(U)；比酶活定義為1 mg 腈水合酶具有的酶活力(U/mg)。反應(yīng)體系：10 μL質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL蛋白加入490 μL含有200 mmol/L煙腈的10 mmol/L H3PO4緩沖溶液中，30 ℃反應(yīng)10 min，加入500 μL的乙腈終止反應(yīng)。過0.22 μm的膜后，C18柱經(jīng)HPLC測其酶活，流動相為乙腈和水[V(水)∶V(乙腈)=2∶1]的混合液，檢測波長為210 nm，檢測溫度為40 ℃，流動相流速為0.6 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，檢測10 min,每組數(shù)據(jù)至少進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 酶學(xué)性質(zhì)研究

(1)最適溫度

分別測定該酶在20、25、30、35、37、40、50 ℃下的酶活，將最高的酶活定義為100%。

(2)最適pH

配含有終濃度為200 mmo/L煙腈的不同pH梯度(pH=5、6、6.5、7、7.5、8、8.5)的10 mmol/L H3PO4緩沖溶液，測定該酶在各pH底物緩沖溶液下的酶活，將最高酶活設(shè)定為100%，分析其隨pH的變化情況。

(3)熱穩(wěn)定性

將本實(shí)驗(yàn)室中研究保存的腈水合酶分離純化，分別為來源于R.rhodochrousJ1的H-NHase(BAG)和L-NHase(BAE)[23-24]、來源于PseudonocardiathermophilaJCM 3095的腈水合酶(Pt-NHase)[25]，來源于PseudomonasputidaNRRL 1886的腈水合酶(Pp-NHase)[26]。將酶質(zhì)量濃度調(diào)到0.5 mg/mL，在金屬浴65 ℃下處理0、0.5、1、2、3、4、5 h取樣，測各腈水合酶的相對酶活，定義各酶處理時間為0 h的酶活為100%，分析其熱穩(wěn)定性情況。

(4)底物及產(chǎn)物耐受性

將誘導(dǎo)培養(yǎng)后的菌液收集菌體，將OD600=8的菌體分別置于煙酰胺濃度為0、1.5、1、1.5、2 mol/L以及煙腈濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mol/L的緩沖溶液中，30 ℃下孵育30 min，12 000 r/min、1 min離心棄上清緩沖液，用10 mmol/L的H3PO4緩沖溶液洗菌體2次，測其殘余酶活，將未經(jīng)處理的菌體酶活定義為100%。分析不同濃度底物和產(chǎn)物的耐受情況。

1.2.6 全細(xì)胞催化生產(chǎn)煙酰胺

將誘導(dǎo)培養(yǎng)后的菌體收集，10 mmol/L、pH=7.4 H3PO4緩沖溶液重懸浮，最終確定反應(yīng)體系為OD600=8，50 mL，催化期間不斷攪拌，控溫在30 ℃左右。分批次將煙腈固體添加到菌液中，檢測催化過程中煙腈的減少量和煙酰胺的生成量，優(yōu)化補(bǔ)料間隔時間和補(bǔ)料濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cal.t NHase基因的異源表達(dá)及分離純化

用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和EcoR Ⅰ對含有目的基因Cal.tNHase的表達(dá)載體pET-24a(+)-Cal.tNHase進(jìn)行雙酶切，酶切結(jié)果通過瓊脂糖核酸凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證(圖1)。除了誘導(dǎo)劑IPTG影響蛋白表達(dá)之外，Co2+對于腈水合酶發(fā)揮活性具有重要作用，但過高的Co2+濃度會抑制菌體生長及蛋白表達(dá)，故分別對Co2+和IPTG濃度進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如圖2-a所示，從SDS-PAGE圖中確定最佳誘導(dǎo)條件為Co2+0.1 g/L、IPTG 0.2 mmol/L。

1-pET-24a(+)-Cal.t NHase;2-雙酶切質(zhì)粒pET24a-Cal.t NHase圖1 Cal.t NHase基因電泳圖Fig.1 Electrophoretogramo of Cal.t NHase gene

通過strep親和層析的方法對目的蛋白進(jìn)行分離純化。因?yàn)樵陔嫠厦钢校钚灾行奈挥讦羴喕?，故選擇在β亞基的N端和C端融合strep標(biāo)簽，從SDS-PAGE(圖2-b)中可以看出將標(biāo)簽加在β亞基的C端可成功純化該酶，而strep標(biāo)簽融合于腈水合酶β亞基的N端時，影響腈水合酶β亞基的正確折疊，β亞基表達(dá)效果不佳，β亞基和α亞基無法正確形成α2β2四聚體，所以strep標(biāo)簽融合于腈水合酶β亞基的N端時無法對目的蛋白Cal.tNHase分離純化，故在后續(xù)的研究中，標(biāo)簽均加在β亞基的C端。

a-優(yōu)化誘導(dǎo)條件蛋白膠圖;b-蛋白純化蛋白膠圖圖2 Cal.t NHase SDS-PAGE圖Fig.2 SDS-PAGE of Cal.t NHase

2.2 酶學(xué)性質(zhì)的分析

不同的反應(yīng)溫度對Cal.tNHase酶活的影響如圖3-a所示，該酶最適溫度為37 ℃，且在35～40 ℃該蛋白酶活差異不大，在低溫下該蛋白酶活較低；不同的pH對Cal.tNHase酶活的影響如圖3-b所示，最適pH為7.0且在pH=6.0～7.5其比酶活變化不大。Cal.tNHase的熱穩(wěn)定性如圖3-c所示，來源于工業(yè)應(yīng)用菌株紅球菌R.rhodochrousJ1的腈水合酶(H-NHase)在65 ℃下處理30 min完全喪失活性，來源于嗜熱假諾卡氏菌P.thermophilaJCM 3095的腈水合酶(Pt-NHase)在65 ℃處理1 h殘余酶活僅為10%，Cal.tNHase在65 ℃下處理3 h仍能維持50%的酶活，相較于其他腈水合酶具有較好的熱穩(wěn)定性，對研究腈水合酶熱穩(wěn)定性具有重要參考價值。此外，良好的熱穩(wěn)定性能夠節(jié)約能耗、降低成本及提高菌體重復(fù)利用率，在工業(yè)應(yīng)用中具有重要意義。

a-最適溫度;b-最適pH;c-不同來源的NHase 65 ℃熱穩(wěn)定性圖3 Cal.t NHase的酶學(xué)性質(zhì)Fig.3 Characterization of Cal.t NHase

PEI等研究發(fā)現(xiàn)PtNHase的β亞基第6個螺旋(Q111-G125)對腈水合酶熱穩(wěn)定性影響較大[10]，Cal.tNHase、PtNHase、PpNHase、L-NHase、H-NHase相對應(yīng)的β亞基第六螺旋序列對比如圖4所示，從序列對比中可以看到此螺旋序列不保守，但熱穩(wěn)定性相對較好的Cal.tNHase、PtNHase和L-NHase的L115、Q121和G126相對保守，可能是影響熱穩(wěn)定性的關(guān)鍵位點(diǎn)。

圖4 影響NHase熱穩(wěn)定性的關(guān)鍵區(qū)域的序列比對Fig.4 Sequence alignment of heat-sensitive region of NHase from different sources

Cal.tNHase底物(煙腈)和產(chǎn)物(煙酰胺)耐受性如圖5所示，用1 mol/L煙腈處理30 min后該酶仍能維持52.87%酶活，用2 mol/L煙酰胺處理30 min仍能維持53.32%酶活。在用底物處理的結(jié)果中可以看到，用0.4 mol/L底物處理能維持88.8%的酶活，0.8 mol/L底物處理時仍能維持69%的酶活，在后續(xù)的全細(xì)胞催化過程中，考慮到底物添加批次及底物濃度過高對酶活影響等因素，選定探索的底物濃度為0.4和0.8 mol/L。

a-底物耐受性;b-產(chǎn)物耐受性圖5 Cal.t NHase底物產(chǎn)物耐受性Fig.5 Tolerance of Cal.t NHase to 3-cyanopyridine and nicotinamide

2.3 全細(xì)胞催化生產(chǎn)煙酰胺

根據(jù)王哲[21]的研究，底物分批補(bǔ)料合成煙酰胺工藝，對全細(xì)胞催化進(jìn)行了優(yōu)化，將底物固體底粉末分批次添加到50 mL，OD600=8的菌液中，不斷攪拌，第1批底物反應(yīng)完后，添加第2批，選擇每批底物濃度為0.4 mol/L(圖6-a)和0.8 mol/L(圖6-c)，最終選定的底物添加濃度為0.4 mol/L對底物添加時間進(jìn)行優(yōu)化，如圖6-a和圖6-b所示，最終選定的時間間隔是6 min，后期可適當(dāng)延長。催化生成煙酰胺的產(chǎn)量比相關(guān)文獻(xiàn)報道以H-NHase催化提高了26.9%。

3 結(jié)論

本文成功實(shí)現(xiàn)了溫泉熱堿芽孢桿菌CaldalkalibacillusthermarumTA2.A1腈水合酶(Cal.tNHase)的異源表達(dá)，通過在β亞基的N端添加strep標(biāo)簽，成功實(shí)現(xiàn)了Cal.tNHase純化，其在65 ℃下的半衰期為3 h，較工業(yè)應(yīng)用的來源于R.rhodochrousJ1的H-NHase熱穩(wěn)定性高。其比酶活為395 U/mg，比H-NHase提高了60%。在全細(xì)胞催化生產(chǎn)煙酰胺過程中，通過對底物添加的優(yōu)化，最佳方式是前期添加時間間隔為6 min，添加量為0.4 mol/(L·次)，最高產(chǎn)量(質(zhì)量濃度)為495.04 g/L。相比之前全細(xì)胞催化研究中，其煙酰胺產(chǎn)量有一定提高，縮短了催化時間，有利于工業(yè)生產(chǎn)。

a-0.4 mol/(L·次)，最初間隔時間10 min;b-0.4 mol/(L·次)，最初間隔時間6 min;c-0.8 mol/(L·次)，最初間隔時間15 min圖6 底物分批補(bǔ)料催化工藝的優(yōu)化Fig.6 Optimization of substrate fed-batch reaction