王蓮哲，江宏浩，唐宜飛，洪軍

(河南城建學院，河南 平頂山，467000)

抗菌肽(antimicrobial peptides, AMPs)是一類抗菌譜廣、耐熱性較強、不易產(chǎn)生耐藥性的小分子多肽，作為抗生素替代品具有良好的應用前景[1-2]。抗菌肽在自然界中分布廣泛，在動植物及細菌、病毒當中都有發(fā)現(xiàn)。目前已經(jīng)從自然界中發(fā)現(xiàn)并分離了2 600多種抗菌肽，并在其制備、抗菌活性、作用機理研究等方面取得了巨大的進展[3]?？咕牡姆肿淤|量比較小，一般由12～50個氨基酸組成，屬于機體天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分。兩棲類動物的表面皮膚腺體分泌的一系列抗菌肽有明顯的抑菌效果，具有潛在應用價值[4]。其中Temporin抗菌肽是目前發(fā)現(xiàn)的最小的抗菌肽，已從不同的兩棲類中分離出20多種，均表現(xiàn)出良好的抑菌活性[5]。海南產(chǎn)沼蛙皮膚Temporin對革蘭氏陽性菌和陰性菌均有很好的抑菌效果[6]，源于Temporin-Pta的雜合肽HX-12A對大腸桿菌等細菌有較高的蛋白酶活穩(wěn)定性抑制作用，Temporin B還有抗病毒活性[7-8]。

盡管Temporin抗菌肽有良好的抗菌活性，但其真核表達少有報道。采用基因工程手段將抗菌肽在微生物中表達是實現(xiàn)其大規(guī)模生產(chǎn)的基礎。目前已有很多其他物種來源的抗菌肽實現(xiàn)了重組表達[9-10]。本項目以新型抗菌肽Temporin-SHf為目標，采用基因工程的方式，實現(xiàn)抗菌肽Temporin-SHf真核表達，分析體外抑菌活性并優(yōu)化誘導條件，為后期獲取低成本，高效的新型抗菌肽制劑提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 質粒及菌株

畢赤酵母菌GS115，畢赤酵母表達載體pPIC9K，大腸桿菌(EscherichiacoliATCC25922)，金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATCC25923)等，為實驗室保存。

1.2 實驗方法

1.2.1 抗菌肽基因合成與表達載體構建

按照抗菌肽數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)公布的抗菌肽Temporin-SHf序列(AP02856)，選用畢赤酵母偏愛密碼子設計優(yōu)化抗菌肽的基因序列，并在其5′端添加EcoR I酶切位點，起始密碼ATG及Kex2酶切位點。在其3′端添加終止密碼子和NotI 酶切位點；該目的基因命名為Temporin-SHf，序列由武漢金開瑞有限公司合成，分別為：Temporin-F：CGGAATTCATGAAAAGATGGTGGTGGTTGAGAAAGATTTGG，Temporin-R：ATT-TGCGGCCGCTCACCAAATCTTTCTCAACCACCAC CA。將上下游引物通過熱退火合成基因序列。經(jīng)EcoR I/NotI雙酶切后與pPIC9K質粒經(jīng) T4連接酶16 ℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉化感受態(tài)大腸桿菌 DH5α，涂布于質量濃度為50 mg/L氨芐青霉素的 LB 瓊脂板，過夜培養(yǎng)后挑取單菌落，菌落PCR鑒定。鑒定用上游引物為5′AOX:GACTGGTTCCAATTGACAAG，下游引物為Temporin-R。PCR擴增反應條件為98 ℃預變性5 min，94 ℃、30 s，57 ℃、30 s，72 ℃、1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)質量濃度為12 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，陽性菌送武漢金開瑞公司測序驗證。

1.2.2 酵母轉化及篩選

從測序成功的菌液中提取重組質粒，用SalI酶切線性化并電轉畢赤酵母(GS115)感受態(tài)，涂布基礎葡萄糖培養(yǎng)基(minimal dextrose，MD)平板，30 ℃培養(yǎng)2～3 d。并用質量濃度為2 g/L G418篩選多拷貝菌株。篩選10個多拷貝轉化子，用試劑盒提取酵母基因組DNA為模板，聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)鑒定，反應條件及引物同1.2.1。以空載體pPIC9K轉化酵母菌GS115做負對照。

1.2.3 酵母菌反轉錄PCR(reverse transcrtion polymerase china reaction，RT-PCR)檢測

取重組酵母菌液，經(jīng)酸洗玻璃珠法破碎細胞，用酵母菌RNA提取試劑盒提RNA，由反轉錄試劑盒(天根生物)反轉錄為cDNA第1條鏈，以此為模板，用特異性引物進行RT-PCR擴增，擴增引物為：Temporin-RT-F：GAATTCATGAAAAGATGGTGG，下游引物Temporin-RT-R：GCGGCCGCTCACCAAA，反應條件同1.2.1。

1.2.4 工程菌的誘導表達及優(yōu)化

挑選陽性轉化子進行甲醇誘導表達。取1 mL菌液接種于50 mL BMGY培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600為2～6，4 ℃，6 000 r/min離心5 min，收集菌體重懸于50 mL BMMY培養(yǎng)基，轉入250 mL錐形瓶振蕩培養(yǎng)，甲醇誘導表達，對甲醇添加量(體積分數(shù)0.5%、1%、1.5%)，溫度(28、30、32 ℃)，誘導起始濃度(OD600=0.5、1、1.5)進行優(yōu)化。每隔24 h加1次甲醇，在誘導的24、48、72、96、120 h取上清用考馬斯亮藍G250法測定蛋白含量，用轉空載體的酵母菌株做負對照，抗菌肽蛋白含量用陽性菌分泌蛋白量減去空載體負對照分泌蛋白量。同時用不同誘導條件下的發(fā)酵上清液做抑菌實驗，用大腸桿菌做指示菌，用抑菌圈直徑(含打孔徑)表示抑菌活性，3組平行實驗統(tǒng)計數(shù)據(jù)并作圖。

1.2.5 抗菌肽抑菌活性分析

用蛋白質量濃度最高的上清液做抑菌活性實驗。采用瓊脂孔穴擴散法進行抑菌分析。用革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌、革蘭氏陰性菌大腸桿菌為指示菌，取培養(yǎng)至對數(shù)生長期指示菌懸液80 μL，涂布于LB固體培養(yǎng)基平板，待其凝固后用無菌打孔器(直徑5 mm)打孔，在孔中分別加入重組畢赤酵母轉化子誘導表達上清100 μL，37 ℃過夜培養(yǎng)，觀察并拍照。用含pPIC9K空載體的轉化子的培養(yǎng)液上清100 μL同上處理作為陰性對照。

2 結果與分析

2.1 重組表達載體鑒定及序列分析

新型抗菌肽Temporin-SHf氨基酸序列為WWWLRKIW，是8個氨基酸的小肽，分子質量1 273 Da，等電點11，親水系數(shù)-0.463，是親水性小肽。將合成的基因通過酶切位點EcoR I和NotI連接在pPIC9K質粒中，轉化大腸桿菌，進行菌落PCR鑒定(圖1)。菌落PCR用載體上5′AOX上游引物，擴增片段在450 bp左右。陽性轉化子送基因測序，結果正確，重組載體構建成功。測序結果序列及對應氨基酸序列如圖2所示，序列上游添加了起始密碼子ATG以及信號肽切割位點Kex2，下游添加了終止密碼子，用以在分泌表達過程切除信號肽，產(chǎn)生完整的小肽。

M-marker DL2000;1-大腸桿菌轉化子菌落PCR圖1 重組質粒菌落PCR鑒定Fig.1 PCR identification of recombinant plasmid

2.2 酵母轉化及鑒定

將重組表達載體轉化畢赤酵母感受態(tài)細胞，MD平板篩選。并用質量濃度為2 g/L G418篩選多拷貝菌株，提取基因組DNA進行外源基因的PCR鑒定。陽性菌株提取酵母RNA，通過RT-PCR驗證目的基因的表達(圖3)。結果表明，重組質粒pPIC9K-Temporin-SHf已經(jīng)成功轉入酵母菌GS115，并能夠穩(wěn)定表達。

M-marker DL2000;1～3-酵母菌轉化子PCR鑒定;4～6-酵母菌轉化子RT-PCRA-PCR鑒定；B-RT-PCR鑒定圖3 重組酵母菌PCR鑒定和RT-PCR鑒定Fig.3 PCR identification and RT-PCR identification of recombinant yeast

2.3 抗菌肽的誘導表達及條件優(yōu)化

將導入目的基因的重組菌株進行誘導表達，分別對溫度，甲醇添加量(體積分數(shù))和起始菌體濃度進行優(yōu)化。在24、48、72、96、120 h取1次上清，用考馬斯亮藍法測定分泌蛋白質量濃度。以轉空載體的酵母菌為陰性對照以去除背景蛋白量。同時以不同誘導條件下的上清液做抑菌實驗，用抑菌圈直徑反映分泌重組抗菌肽的抑菌活性(圖4)。由圖4-A可知，對甲醇添加量分別按0.5%，1%，1.5%(體積分數(shù))進行優(yōu)化，隨著誘導時間延長，重組抗菌肽蛋白表達質量濃度逐漸升高，甲醇添加量(體積分數(shù))0.5%，誘導時間96 h，出現(xiàn)蛋白表達量峰值0.042 g/L。甲醇添加量(體積分數(shù))為1%時整體趨勢和添加量(體積分數(shù))為0.5%較為相似。而甲醇添加量(體積分數(shù))為1.5%時，在誘導的前48 h蛋白濃度較高，超過48 h以后蛋白濃度開始下降，可能是甲醇濃度過高對細胞產(chǎn)生了毒害作用。分泌重組抗菌肽的抑菌活性分析(圖4-D)，隨著誘導時間延長，重組抗菌肽抑菌圈逐漸增大，甲醇添加量(體積分數(shù))在0.5%，誘導時間72 h，抑菌圈最大，說明重組抗菌肽抑菌活性最強。

如圖4-B所示，對BMMY培養(yǎng)基誘導過程起始菌體濃度進行優(yōu)化，結果表明，起始菌體濃度越高則蛋白表達量相對較高，峰值出現(xiàn)在菌體起始濃度OD600為1.5，誘導72 h，蛋白表達量(質量濃度)為0.045 g/L。但在誘導72 h以后，蛋白表達量開始下降。起始菌體濃度優(yōu)化的抑菌活性分析結果類似，起始菌體濃度越高則抑菌活性相對較高，抑菌圈峰值出現(xiàn)在菌體起始濃度OD600為1.5，誘導72 h(圖4-E)。圖4-C是對不同誘導溫度進行優(yōu)化，結果表明誘導溫度28 ℃下蛋白表達量整體偏高，峰值出現(xiàn)在28 ℃誘導72 h，蛋白表達量(質量濃度)為0.056 g/L，隨后蛋白質量濃度又逐漸下降。可能是和菌體老化相關。不同溫度條件下的抑菌活性分析結果顯示，28 ℃相比另外2個溫度，抑菌圈相對較大，隨著時間延長，抑菌圈增大，但在72 h后開始下降。抑菌活性峰值出現(xiàn)在28 ℃誘導72 h(圖4-F)。對誘導條件優(yōu)化綜合分析，從蛋白表達量和發(fā)酵上清液的抑菌活性分析對誘導條件優(yōu)化得到結果基本一致，在甲醇添加量(體積分數(shù))0.5%，誘導菌體起始濃度OD600為1.5，溫度28 ℃，轉速180 r/min，誘導72 h，分泌蛋白表達量最高，且重組抗菌肽的抑菌活性最強。

A-甲醇添加量優(yōu)化(蛋白表達量);B-起始菌體濃度優(yōu)化(蛋白表達量);C-誘導溫度優(yōu)化(蛋白表達量)；D-甲醇添加量優(yōu)化(抑菌圈直徑);E-起始菌體濃度優(yōu)化(抑菌圈直徑);F-誘導溫度優(yōu)化(抑菌圈直徑)圖4 不同誘導條件下重組蛋白表達量及抑菌圈直徑Fig.4 Expression of recombinant protein and antibacterial activity under different induced conditions

2.4 體外抑菌活性分析

為了檢測重組抗菌肽的體外抑菌活性，用革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性菌大腸桿菌做指示菌，用瓊脂孔穴擴散法進行抑菌活性分析。圖5顯示畢赤酵母分泌表達的抗菌肽對2種指示菌都有明顯的抑菌圈，而轉化空載體的酵母菌上清液對照沒有抑菌圈，說明畢赤酵母轉空載體本底水平分泌代謝產(chǎn)物沒有抑菌活性，結果表明表達產(chǎn)物中主要是重組抗菌肽發(fā)揮抑菌作用，重組抗菌肽對革蘭氏陰性和陽性菌均有良好的抑菌活性。

1-對照；2～4-重組蛋白A-大腸桿菌;B-金黃色葡萄球菌圖5 重組抗菌肽體外抑菌活性分析Fig.5 Analysis of antibacterial activity of recombinant peptide in vitro

3 討論

抗菌肽具有獨特的殺菌機制和較好的理化性質,有望成為抗生素替代品，在藥物研發(fā)以及農業(yè)、食品工業(yè)生產(chǎn)中都具有很廣闊的應用前景?？咕氖嵌嚯念惢钚晕镔|，具有很強的抑菌活性。抗菌肽可以從生物中提取，但是提取率低，采用化學合成法成本較高，不適用于大規(guī)模生產(chǎn)。因此用基因工程的手段來生產(chǎn)抗菌肽成為首選方法[11-12]。畢赤酵母表達系統(tǒng)具有易于操作，遺傳系統(tǒng)穩(wěn)定及蛋白表達量高等優(yōu)點，被廣泛應用到抗菌肽的表達[13]。目前應用畢赤酵母表達系統(tǒng)已經(jīng)實現(xiàn)了泥鰍抗菌肽[14]、重組抗菌肽LFcinB-W4[15]， 厚殼貽貝抗菌肽Mytilins[16]等的表達。本文通過基因工程的手段利用畢赤酵母密碼子偏愛性設計出一種新型抗菌肽Temporin-SHf，通過構建pPIC9K-Temporin-SHf重組表達載體，轉化到畢赤酵母中實現(xiàn)其分泌表達。

畢赤酵母系統(tǒng)通過乙醇氧化酶基因啟動子(AOX1)，穩(wěn)定表達外源基因。甲醇誘導的溫度、甲醇添加量、誘導時間，起始菌體濃度等都會對抗菌肽的表達水平產(chǎn)生影響。抗菌肽cecropin A經(jīng)過誘導條件優(yōu)化，在體積分數(shù)為0.5%甲醇誘導，28 ℃發(fā)酵48 h分泌表達抗菌肽質量濃度最高，抑菌活性最強[17]。雜合肽LPCB在0.5%(體積分數(shù))甲醇，溫度25 ℃誘導72 h后，表達量最大[18]?？咕腄CD-1L在畢赤酵母SMD1168中表達最適表達時間為48 h，溫度為28 ℃，pH值為6，甲醇誘導量為終含量(體積分數(shù))0.5%，表達量最大[19]。28 ℃、250 r/min誘導培養(yǎng)，每24 h添加體積分數(shù)0.5%的甲醇，誘導時間120 h，抗菌肽MgJ表達量(質量濃度)可達11.9 mg/L[20]。本研究中對重組抗菌肽Temporin-SHf 誘導表達的時間、溫度、菌體起始濃度、甲醇添加量(體積分數(shù))進行優(yōu)化。甲醇可以誘導外源基因表達，蛋白表達量及蛋白抑菌效果。結果表明，當甲醇終含量(體積分數(shù))0.5%誘導72 h 重組蛋白含量和抑菌活性均為最優(yōu)。甲醇過大可能對菌體產(chǎn)生毒害作用，造成分泌蛋白表達量下降。菌體起始濃度對外源蛋白質量表達存在正向關系，但在誘導72 h以后蛋白濃度下降，可能菌體出現(xiàn)老化影響了分泌蛋白表達。溫度對于蛋白表達也有很大影響，畢赤酵母的最適生長溫度在25～30 ℃，培養(yǎng)溫度過高或過低都將顯著影響其產(chǎn)物表達量。通過溫度條件優(yōu)化，結果顯示28 ℃誘導雜合肽的蛋白表達量最高，抑菌活性最強。綜合分析表明在甲醇添加量(體積分數(shù))0.5%，誘導菌體起始濃度OD600為1.5，溫度28 ℃，轉速180 r/min，誘導72 h，分泌蛋白表達量(質量濃度)最高，達到0.056 g/L，分泌蛋白抑菌活性最強。分泌表達蛋白對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性菌大腸桿菌都有明顯的抑菌效果。

4 結論

通過基因工程的手段利用畢赤酵母密碼子偏愛性設計出一種新型抗菌肽，構建pPIC9K-Temporin-SHf重組表達載體，轉化到畢赤酵母中實現(xiàn)其分泌表達。在甲醇添加量(體積分數(shù))0.5%，誘導菌體起始濃度OD600為1.5，溫度28 ℃，轉速180 r/min，誘導72 h，分泌蛋白表達量最高。分泌表達蛋白對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性菌大腸桿菌都有明顯的抑菌效果。