王蓮哲，江宏浩，唐宜飛，洪軍

(河南城建學(xué)院，河南 平頂山，467000)

抗菌肽(antimicrobial peptides, AMPs)是一類抗菌譜廣、耐熱性較強(qiáng)、不易產(chǎn)生耐藥性的小分子多肽，作為抗生素替代品具有良好的應(yīng)用前景[1-2]?？咕脑谧匀唤缰蟹植紡V泛，在動(dòng)植物及細(xì)菌、病毒當(dāng)中都有發(fā)現(xiàn)。目前已經(jīng)從自然界中發(fā)現(xiàn)并分離了2 600多種抗菌肽，并在其制備、抗菌活性、作用機(jī)理研究等方面取得了巨大的進(jìn)展[3]?？咕牡姆肿淤|(zhì)量比較小，一般由12～50個(gè)氨基酸組成，屬于機(jī)體天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分。兩棲類動(dòng)物的表面皮膚腺體分泌的一系列抗菌肽有明顯的抑菌效果，具有潛在應(yīng)用價(jià)值[4]。其中Temporin抗菌肽是目前發(fā)現(xiàn)的最小的抗菌肽，已從不同的兩棲類中分離出20多種，均表現(xiàn)出良好的抑菌活性[5]。海南產(chǎn)沼蛙皮膚Temporin對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌均有很好的抑菌效果[6]，源于Temporin-Pta的雜合肽HX-12A對(duì)大腸桿菌等細(xì)菌有較高的蛋白酶活穩(wěn)定性抑制作用，Temporin B還有抗病毒活性[7-8]。

盡管Temporin抗菌肽有良好的抗菌活性，但其真核表達(dá)少有報(bào)道。采用基因工程手段將抗菌肽在微生物中表達(dá)是實(shí)現(xiàn)其大規(guī)模生產(chǎn)的基礎(chǔ)。目前已有很多其他物種來(lái)源的抗菌肽實(shí)現(xiàn)了重組表達(dá)[9-10]。本項(xiàng)目以新型抗菌肽Temporin-SHf為目標(biāo)，采用基因工程的方式，實(shí)現(xiàn)抗菌肽Temporin-SHf真核表達(dá)，分析體外抑菌活性并優(yōu)化誘導(dǎo)條件，為后期獲取低成本，高效的新型抗菌肽制劑提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒及菌株

畢赤酵母菌GS115，畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K，大腸桿菌(EscherichiacoliATCC25922)，金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATCC25923)等，為實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 抗菌肽基因合成與表達(dá)載體構(gòu)建

按照抗菌肽數(shù)據(jù)庫(kù)中已經(jīng)公布的抗菌肽Temporin-SHf序列(AP02856)，選用畢赤酵母偏愛(ài)密碼子設(shè)計(jì)優(yōu)化抗菌肽的基因序列，并在其5′端添加EcoR I酶切位點(diǎn)，起始密碼ATG及Kex2酶切位點(diǎn)。在其3′端添加終止密碼子和NotI 酶切位點(diǎn)；該目的基因命名為Temporin-SHf，序列由武漢金開(kāi)瑞有限公司合成，分別為：Temporin-F：CGGAATTCATGAAAAGATGGTGGTGGTTGAGAAAGATTTGG，Temporin-R：ATT-TGCGGCCGCTCACCAAATCTTTCTCAACCACCAC CA。將上下游引物通過(guò)熱退火合成基因序列。經(jīng)EcoR I/NotI雙酶切后與pPIC9K質(zhì)粒經(jīng) T4連接酶16 ℃連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌 DH5α，涂布于質(zhì)量濃度為50 mg/L氨芐青霉素的 LB 瓊脂板，過(guò)夜培養(yǎng)后挑取單菌落，菌落PCR鑒定。鑒定用上游引物為5′AOX:GACTGGTTCCAATTGACAAG，下游引物為Temporin-R。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為98 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃、30 s，57 ℃、30 s，72 ℃、1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量濃度為12 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，陽(yáng)性菌送武漢金開(kāi)瑞公司測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.2 酵母轉(zhuǎn)化及篩選

從測(cè)序成功的菌液中提取重組質(zhì)粒，用SalI酶切線性化并電轉(zhuǎn)畢赤酵母(GS115)感受態(tài)，涂布基礎(chǔ)葡萄糖培養(yǎng)基(minimal dextrose，MD)平板，30 ℃培養(yǎng)2～3 d。并用質(zhì)量濃度為2 g/L G418篩選多拷貝菌株。篩選10個(gè)多拷貝轉(zhuǎn)化子，用試劑盒提取酵母基因組DNA為模板，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)鑒定，反應(yīng)條件及引物同1.2.1。以空載體pPIC9K轉(zhuǎn)化酵母菌GS115做負(fù)對(duì)照。

1.2.3 酵母菌反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcrtion polymerase china reaction，RT-PCR)檢測(cè)

取重組酵母菌液，經(jīng)酸洗玻璃珠法破碎細(xì)胞，用酵母菌RNA提取試劑盒提RNA，由反轉(zhuǎn)錄試劑盒(天根生物)反轉(zhuǎn)錄為cDNA第1條鏈，以此為模板，用特異性引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物為：Temporin-RT-F：GAATTCATGAAAAGATGGTGG，下游引物Temporin-RT-R：GCGGCCGCTCACCAAA，反應(yīng)條件同1.2.1。

1.2.4 工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)及優(yōu)化

挑選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá)。取1 mL菌液接種于50 mL BMGY培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600為2～6，4 ℃，6 000 r/min離心5 min，收集菌體重懸于50 mL BMMY培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)入250 mL錐形瓶振蕩培養(yǎng)，甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，對(duì)甲醇添加量(體積分?jǐn)?shù)0.5%、1%、1.5%)，溫度(28、30、32 ℃)，誘導(dǎo)起始濃度(OD600=0.5、1、1.5)進(jìn)行優(yōu)化。每隔24 h加1次甲醇，在誘導(dǎo)的24、48、72、96、120 h取上清用考馬斯亮藍(lán)G250法測(cè)定蛋白含量，用轉(zhuǎn)空載體的酵母菌株做負(fù)對(duì)照，抗菌肽蛋白含量用陽(yáng)性菌分泌蛋白量減去空載體負(fù)對(duì)照分泌蛋白量。同時(shí)用不同誘導(dǎo)條件下的發(fā)酵上清液做抑菌實(shí)驗(yàn)，用大腸桿菌做指示菌，用抑菌圈直徑(含打孔徑)表示抑菌活性，3組平行實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)并作圖。

1.2.5 抗菌肽抑菌活性分析

用蛋白質(zhì)量濃度最高的上清液做抑菌活性實(shí)驗(yàn)。采用瓊脂孔穴擴(kuò)散法進(jìn)行抑菌分析。用革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌、革蘭氏陰性菌大腸桿菌為指示菌，取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期指示菌懸液80 μL，涂布于LB固體培養(yǎng)基平板，待其凝固后用無(wú)菌打孔器(直徑5 mm)打孔，在孔中分別加入重組畢赤酵母轉(zhuǎn)化子誘導(dǎo)表達(dá)上清100 μL，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，觀察并拍照。用含pPIC9K空載體的轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)液上清100 μL同上處理作為陰性對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組表達(dá)載體鑒定及序列分析

新型抗菌肽Temporin-SHf氨基酸序列為WWWLRKIW，是8個(gè)氨基酸的小肽，分子質(zhì)量1 273 Da，等電點(diǎn)11，親水系數(shù)-0.463，是親水性小肽。將合成的基因通過(guò)酶切位點(diǎn)EcoR I和NotI連接在pPIC9K質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，進(jìn)行菌落PCR鑒定(圖1)。菌落PCR用載體上5′AOX上游引物，擴(kuò)增片段在450 bp左右。陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子送基因測(cè)序，結(jié)果正確，重組載體構(gòu)建成功。測(cè)序結(jié)果序列及對(duì)應(yīng)氨基酸序列如圖2所示，序列上游添加了起始密碼子ATG以及信號(hào)肽切割位點(diǎn)Kex2，下游添加了終止密碼子，用以在分泌表達(dá)過(guò)程切除信號(hào)肽，產(chǎn)生完整的小肽。

M-marker DL2000;1-大腸桿菌轉(zhuǎn)化子菌落PCR圖1 重組質(zhì)粒菌落PCR鑒定Fig.1 PCR identification of recombinant plasmid

2.2 酵母轉(zhuǎn)化及鑒定

將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞，MD平板篩選。并用質(zhì)量濃度為2 g/L G418篩選多拷貝菌株，提取基因組DNA進(jìn)行外源基因的PCR鑒定。陽(yáng)性菌株提取酵母RNA，通過(guò)RT-PCR驗(yàn)證目的基因的表達(dá)(圖3)。結(jié)果表明，重組質(zhì)粒pPIC9K-Temporin-SHf已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入酵母菌GS115，并能夠穩(wěn)定表達(dá)。

M-marker DL2000;1～3-酵母菌轉(zhuǎn)化子PCR鑒定;4～6-酵母菌轉(zhuǎn)化子RT-PCRA-PCR鑒定；B-RT-PCR鑒定圖3 重組酵母菌PCR鑒定和RT-PCR鑒定Fig.3 PCR identification and RT-PCR identification of recombinant yeast

2.3 抗菌肽的誘導(dǎo)表達(dá)及條件優(yōu)化

將導(dǎo)入目的基因的重組菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，分別對(duì)溫度，甲醇添加量(體積分?jǐn)?shù))和起始菌體濃度進(jìn)行優(yōu)化。在24、48、72、96、120 h取1次上清，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定分泌蛋白質(zhì)量濃度。以轉(zhuǎn)空載體的酵母菌為陰性對(duì)照以去除背景蛋白量。同時(shí)以不同誘導(dǎo)條件下的上清液做抑菌實(shí)驗(yàn)，用抑菌圈直徑反映分泌重組抗菌肽的抑菌活性(圖4)。由圖4-A可知，對(duì)甲醇添加量分別按0.5%，1%，1.5%(體積分?jǐn)?shù))進(jìn)行優(yōu)化，隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)，重組抗菌肽蛋白表達(dá)質(zhì)量濃度逐漸升高，甲醇添加量(體積分?jǐn)?shù))0.5%，誘導(dǎo)時(shí)間96 h，出現(xiàn)蛋白表達(dá)量峰值0.042 g/L。甲醇添加量(體積分?jǐn)?shù))為1%時(shí)整體趨勢(shì)和添加量(體積分?jǐn)?shù))為0.5%較為相似。而甲醇添加量(體積分?jǐn)?shù))為1.5%時(shí)，在誘導(dǎo)的前48 h蛋白濃度較高，超過(guò)48 h以后蛋白濃度開(kāi)始下降，可能是甲醇濃度過(guò)高對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生了毒害作用。分泌重組抗菌肽的抑菌活性分析(圖4-D)，隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)，重組抗菌肽抑菌圈逐漸增大，甲醇添加量(體積分?jǐn)?shù))在0.5%，誘導(dǎo)時(shí)間72 h，抑菌圈最大，說(shuō)明重組抗菌肽抑菌活性最強(qiáng)。

如圖4-B所示，對(duì)BMMY培養(yǎng)基誘導(dǎo)過(guò)程起始菌體濃度進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，起始菌體濃度越高則蛋白表達(dá)量相對(duì)較高，峰值出現(xiàn)在菌體起始濃度OD600為1.5，誘導(dǎo)72 h，蛋白表達(dá)量(質(zhì)量濃度)為0.045 g/L。但在誘導(dǎo)72 h以后，蛋白表達(dá)量開(kāi)始下降。起始菌體濃度優(yōu)化的抑菌活性分析結(jié)果類似，起始菌體濃度越高則抑菌活性相對(duì)較高，抑菌圈峰值出現(xiàn)在菌體起始濃度OD600為1.5，誘導(dǎo)72 h(圖4-E)。圖4-C是對(duì)不同誘導(dǎo)溫度進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明誘導(dǎo)溫度28 ℃下蛋白表達(dá)量整體偏高，峰值出現(xiàn)在28 ℃誘導(dǎo)72 h，蛋白表達(dá)量(質(zhì)量濃度)為0.056 g/L，隨后蛋白質(zhì)量濃度又逐漸下降。可能是和菌體老化相關(guān)。不同溫度條件下的抑菌活性分析結(jié)果顯示，28 ℃相比另外2個(gè)溫度，抑菌圈相對(duì)較大，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，抑菌圈增大，但在72 h后開(kāi)始下降。抑菌活性峰值出現(xiàn)在28 ℃誘導(dǎo)72 h(圖4-F)。對(duì)誘導(dǎo)條件優(yōu)化綜合分析，從蛋白表達(dá)量和發(fā)酵上清液的抑菌活性分析對(duì)誘導(dǎo)條件優(yōu)化得到結(jié)果基本一致，在甲醇添加量(體積分?jǐn)?shù))0.5%，誘導(dǎo)菌體起始濃度OD600為1.5，溫度28 ℃，轉(zhuǎn)速180 r/min，誘導(dǎo)72 h，分泌蛋白表達(dá)量最高，且重組抗菌肽的抑菌活性最強(qiáng)。

A-甲醇添加量?jī)?yōu)化(蛋白表達(dá)量);B-起始菌體濃度優(yōu)化(蛋白表達(dá)量);C-誘導(dǎo)溫度優(yōu)化(蛋白表達(dá)量)；D-甲醇添加量?jī)?yōu)化(抑菌圈直徑);E-起始菌體濃度優(yōu)化(抑菌圈直徑);F-誘導(dǎo)溫度優(yōu)化(抑菌圈直徑)圖4 不同誘導(dǎo)條件下重組蛋白表達(dá)量及抑菌圈直徑Fig.4 Expression of recombinant protein and antibacterial activity under different induced conditions

2.4 體外抑菌活性分析

為了檢測(cè)重組抗菌肽的體外抑菌活性，用革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性菌大腸桿菌做指示菌，用瓊脂孔穴擴(kuò)散法進(jìn)行抑菌活性分析。圖5顯示畢赤酵母分泌表達(dá)的抗菌肽對(duì)2種指示菌都有明顯的抑菌圈，而轉(zhuǎn)化空載體的酵母菌上清液對(duì)照沒(méi)有抑菌圈，說(shuō)明畢赤酵母轉(zhuǎn)空載體本底水平分泌代謝產(chǎn)物沒(méi)有抑菌活性，結(jié)果表明表達(dá)產(chǎn)物中主要是重組抗菌肽發(fā)揮抑菌作用，重組抗菌肽對(duì)革蘭氏陰性和陽(yáng)性菌均有良好的抑菌活性。

1-對(duì)照；2～4-重組蛋白A-大腸桿菌;B-金黃色葡萄球菌圖5 重組抗菌肽體外抑菌活性分析Fig.5 Analysis of antibacterial activity of recombinant peptide in vitro

3 討論

抗菌肽具有獨(dú)特的殺菌機(jī)制和較好的理化性質(zhì),有望成為抗生素替代品，在藥物研發(fā)以及農(nóng)業(yè)、食品工業(yè)生產(chǎn)中都具有很廣闊的應(yīng)用前景。抗菌肽是多肽類活性物質(zhì)，具有很強(qiáng)的抑菌活性?？咕目梢詮纳镏刑崛。翘崛÷实?，采用化學(xué)合成法成本較高，不適用于大規(guī)模生產(chǎn)。因此用基因工程的手段來(lái)生產(chǎn)抗菌肽成為首選方法[11-12]。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)具有易于操作，遺傳系統(tǒng)穩(wěn)定及蛋白表達(dá)量高等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用到抗菌肽的表達(dá)[13]。目前應(yīng)用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了泥鰍抗菌肽[14]、重組抗菌肽LFcinB-W4[15]， 厚殼貽貝抗菌肽Mytilins[16]等的表達(dá)。本文通過(guò)基因工程的手段利用畢赤酵母密碼子偏愛(ài)性設(shè)計(jì)出一種新型抗菌肽Temporin-SHf，通過(guò)構(gòu)建pPIC9K-Temporin-SHf重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化到畢赤酵母中實(shí)現(xiàn)其分泌表達(dá)。

畢赤酵母系統(tǒng)通過(guò)乙醇氧化酶基因啟動(dòng)子(AOX1)，穩(wěn)定表達(dá)外源基因。甲醇誘導(dǎo)的溫度、甲醇添加量、誘導(dǎo)時(shí)間，起始菌體濃度等都會(huì)對(duì)抗菌肽的表達(dá)水平產(chǎn)生影響?？咕腸ecropin A經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)條件優(yōu)化，在體積分?jǐn)?shù)為0.5%甲醇誘導(dǎo)，28 ℃發(fā)酵48 h分泌表達(dá)抗菌肽質(zhì)量濃度最高，抑菌活性最強(qiáng)[17]。雜合肽LPCB在0.5%(體積分?jǐn)?shù))甲醇，溫度25 ℃誘導(dǎo)72 h后，表達(dá)量最大[18]。抗菌肽DCD-1L在畢赤酵母SMD1168中表達(dá)最適表達(dá)時(shí)間為48 h，溫度為28 ℃，pH值為6，甲醇誘導(dǎo)量為終含量(體積分?jǐn)?shù))0.5%，表達(dá)量最大[19]。28 ℃、250 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)，每24 h添加體積分?jǐn)?shù)0.5%的甲醇，誘導(dǎo)時(shí)間120 h，抗菌肽MgJ表達(dá)量(質(zhì)量濃度)可達(dá)11.9 mg/L[20]。本研究中對(duì)重組抗菌肽Temporin-SHf 誘導(dǎo)表達(dá)的時(shí)間、溫度、菌體起始濃度、甲醇添加量(體積分?jǐn)?shù))進(jìn)行優(yōu)化。甲醇可以誘導(dǎo)外源基因表達(dá)，蛋白表達(dá)量及蛋白抑菌效果。結(jié)果表明，當(dāng)甲醇終含量(體積分?jǐn)?shù))0.5%誘導(dǎo)72 h 重組蛋白含量和抑菌活性均為最優(yōu)。甲醇過(guò)大可能對(duì)菌體產(chǎn)生毒害作用，造成分泌蛋白表達(dá)量下降。菌體起始濃度對(duì)外源蛋白質(zhì)量表達(dá)存在正向關(guān)系，但在誘導(dǎo)72 h以后蛋白濃度下降，可能菌體出現(xiàn)老化影響了分泌蛋白表達(dá)。溫度對(duì)于蛋白表達(dá)也有很大影響，畢赤酵母的最適生長(zhǎng)溫度在25～30 ℃，培養(yǎng)溫度過(guò)高或過(guò)低都將顯著影響其產(chǎn)物表達(dá)量。通過(guò)溫度條件優(yōu)化，結(jié)果顯示28 ℃誘導(dǎo)雜合肽的蛋白表達(dá)量最高，抑菌活性最強(qiáng)。綜合分析表明在甲醇添加量(體積分?jǐn)?shù))0.5%，誘導(dǎo)菌體起始濃度OD600為1.5，溫度28 ℃，轉(zhuǎn)速180 r/min，誘導(dǎo)72 h，分泌蛋白表達(dá)量(質(zhì)量濃度)最高，達(dá)到0.056 g/L，分泌蛋白抑菌活性最強(qiáng)。分泌表達(dá)蛋白對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性菌大腸桿菌都有明顯的抑菌效果。

4 結(jié)論

通過(guò)基因工程的手段利用畢赤酵母密碼子偏愛(ài)性設(shè)計(jì)出一種新型抗菌肽，構(gòu)建pPIC9K-Temporin-SHf重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化到畢赤酵母中實(shí)現(xiàn)其分泌表達(dá)。在甲醇添加量(體積分?jǐn)?shù))0.5%，誘導(dǎo)菌體起始濃度OD600為1.5，溫度28 ℃，轉(zhuǎn)速180 r/min，誘導(dǎo)72 h，分泌蛋白表達(dá)量最高。分泌表達(dá)蛋白對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性菌大腸桿菌都有明顯的抑菌效果。