汪嘉炎 李文英

(1.寧波大學(xué) 材料科學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，浙江 寧波 315211；2.寧波大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，浙江 寧波 315211)

0 引言

四環(huán)素類抗生素(TCs)是廣譜抗生素，對革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、衣原體、支原體、螺旋體和放線菌都有較強(qiáng)的作用，因此被廣泛用于水產(chǎn)養(yǎng)殖和畜牧業(yè)[1,2].過度使用TCs可能會(huì)導(dǎo)致食品和環(huán)境中存在抗生素殘留，長期攝入殘留四環(huán)素的食物會(huì)嚴(yán)重威脅人類健康，包括出現(xiàn)抗生素耐藥性，過敏反應(yīng)，肝臟和牙齒損害等[2,3].歐盟和美國食品藥品監(jiān)督管理局公布的食品中允許的四環(huán)素類抗生素的含量最大值為分別為225 nM和676 nM，中國標(biāo)準(zhǔn)為100 μg·mL-1與歐盟標(biāo)準(zhǔn)一致.因此，對環(huán)境及畜牧業(yè)產(chǎn)品中的四環(huán)素進(jìn)行監(jiān)測具有重要的意義.

目前，已經(jīng)報(bào)導(dǎo)的用于TCs檢測的方法包括高效液相色譜法[4,5]、質(zhì)譜分析法[6,7]、免疫法[8,9]、電泳法[10,11]和微生物法[12,13]等.然而，上述方法仍有一些缺點(diǎn)，例如質(zhì)譜分析儀價(jià)格昂貴，高效液相色譜法比較費(fèi)時(shí)，而免疫法和微生物法樣品制備較為復(fù)雜[14,15].熒光分析法相對操作簡單、響應(yīng)時(shí)間快、靈敏度高，且易于設(shè)計(jì)成試紙條，因此，很多研究者致力于發(fā)展可應(yīng)用于四環(huán)素檢測的熒光分析方法[16,17].

四環(huán)素能夠淬滅發(fā)光材料的熒光，因此許多檢測四環(huán)素的熒光分析方法都是基于合成新穎的熒光納米材料，目前已經(jīng)報(bào)道的可以用于四環(huán)素檢測的熒光材料有量子點(diǎn)[18,19]、碳點(diǎn)[20,21]、熒光共軛聚合物[22,23]以及熒光金屬有機(jī)骨架[24-26]等.金屬有機(jī)骨架材料(MOF)是一類由金屬離子與有機(jī)配體組成的化合物，由于它具有比表面積大、化學(xué)組成可調(diào)、孔結(jié)構(gòu)可控、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定和制備過程簡單等優(yōu)點(diǎn)，所以受到了研究者的廣泛關(guān)注[27-34].基于金屬有機(jī)骨架的熒光納米材料，其光譜和孔隙易于通過改變配體而調(diào)節(jié)，且容易進(jìn)行共價(jià)修飾，因此在傳感檢測方面被廣泛應(yīng)用，已經(jīng)被報(bào)道用于金屬離子、硝基甲烷、氣體、pH值以及溫度等的檢測[35-39].但是，傳統(tǒng)的MOF通常水穩(wěn)定性和水溶性都較差，不利于水體中有毒有害物質(zhì)的檢測.本工作以銅離子為配位金屬，5-氨基間苯二甲酸為配體，合成了一種發(fā)藍(lán)色熒光的Cu-MOF的片層結(jié)構(gòu)，并利用四環(huán)素類抗生素對Cu-MOF熒光的淬滅作用，構(gòu)建了一種四環(huán)素類抗生素的檢測方法.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

硝酸銅、5-氨基間苯二甲酸、各種金屬鹽溶液、頭孢購于上海阿拉丁試劑有限公司.土霉素(OTC)，金霉素、強(qiáng)力霉素(DOXC)，青霉素，氨芐青霉素，以及配置緩沖液所用試劑購自生工生物技術(shù)有限公司(中國上海).所有化學(xué)藥品均為分析試劑級(jí)，市售，購買后直接使用未經(jīng)任何處理.

1.2 表征與測試儀器

合成的納米材料的形貌和組成由美國掃描電子顯微鏡、美國Thermo Fisher ESCALAB 250Xi X射線光電子能譜儀進(jìn)行分析.紫外可見吸收光譜由中國上海光譜儀器有限公司紫外可見分光光度計(jì)測量獲得，熒光光譜測量儀器為日本島津熒光分光光度計(jì)(RF-5301)，熒光壽命測量儀器為法國HoribaJobin Yvon熒光光譜儀FL3-TCSPC.

1.3 發(fā)光Cu-MOF的合成

將0.2 g PVP充分溶解于4 mL乙醇和4 mL DMF，得到溶液A；將0.024 g Cu(NO3)2·3H2O和0.0054 g 5-氨基間苯二甲酸充分溶解于4 mL DMF，得到溶液B；將溶液A和溶液B混勻并超聲作用20 min；然后將上述混合液轉(zhuǎn)移至反應(yīng)釜中升溫至100 ℃并反應(yīng)8 h；反應(yīng)結(jié)束后離心醇洗3次,干燥后得到藍(lán)色Cu-MOF粉末；最后稱取適量Cu-MOF粉末溶于去離子水中得到0.2 mg/mL的溶液備用.

1.4 發(fā)光Cu-MOF的光譜性質(zhì)

將200 μL 10 mM MOPS緩沖液(pH 7.0)，60 μL 鹽酸四環(huán)素溶液(儲(chǔ)存液濃度：1 mM)，不同體積Cu-MOF溶液(儲(chǔ)存液濃度：0.2 mg mL-1)和去離子水加入到樣品管中，使其總體積為2 mL.在該測試體系中，Cu-MOF溶液濃度分別為5、10、20、30、40 μg mL-1.所得測試體系在室溫下孵育5 min，然后進(jìn)行光譜測試.

1.5 四環(huán)素分析檢測

標(biāo)準(zhǔn)曲線：將200 μL 10 mM MOPS緩沖液(pH 7.0)，100 μL Cu-MOF溶液(儲(chǔ)存液濃度：0.2 mg mL-1)，不同體積的鹽酸四環(huán)素溶液(儲(chǔ)存液濃度：1 mM)和去離子水加入到樣品管中，使其總體積為2 mL.在該測試體系中，鹽酸四環(huán)素濃度分別為0、1、2.5、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100和110 μM.所得測試體系在室溫下孵育5 min，然后進(jìn)行光譜測試.

選擇性考察：對于干擾實(shí)驗(yàn)，將200 μL 1 mM干擾分析物添加到測試體系中，干擾分析物的最終濃度均為100 μM，其他條件與標(biāo)準(zhǔn)曲線測試保持一致.

實(shí)際樣品檢測：環(huán)境水樣品測試取自寧波市甬江水(寧波大學(xué)附近支流)作為測試樣品，甬江水經(jīng)過簡單離心處理即可進(jìn)行測試.

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)光Cu-MOF的表征

合成的Cu-MOF的形貌用SEM進(jìn)行了表征，如圖1(a)所示.從圖中可以看出，合成的Cu-MOF展示出了二維的片狀結(jié)構(gòu)，片狀結(jié)構(gòu)交錯(cuò)形成花狀結(jié)構(gòu).這種平面結(jié)構(gòu)有利于四環(huán)素與Cu-MOF之間的相互作用.X射線光電子能譜用于分析Cu-MOF的組成，如圖1(b)所示，合成的Cu-MOF主要由Cu、C、N和O四種元素組成.其中C、O以及N元素來自于配體和PVP，而金屬來自于參與配位的銅鹽.

圖1 (a)發(fā)光Cu-MOF的SEM圖；(b)Cu-MOF的XPS圖

發(fā)光Cu-MOF的光學(xué)性質(zhì)通過紫外可見吸收光譜、熒光激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜分別進(jìn)行表征.如圖2(a)所示，所合成的Cu-MOF材料在302 nm處具有一個(gè)明顯的吸收峰；此外，根據(jù)熒光激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜，Cu-MOF的最大激發(fā)波長和最大發(fā)射波長分別為318 nm和402 nm.如圖2(b)所示，通過考察不同激發(fā)波長下，Cu-MOF在402 nm處所發(fā)射的熒光強(qiáng)度也可以發(fā)現(xiàn)，Cu-MOF的熒光強(qiáng)度是依賴于激發(fā)波長的，這表明Cu-MOF在測試體系中是均勻分布的.

圖2 (a) Cu-MOF的紫外可見吸收光譜、熒光激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜；(b) 不同激發(fā)波長下Cu-MOF的熒光強(qiáng)度

為探究pH對熒光強(qiáng)度的影響，依次測定Cu-MOF在pH=4-9的熒光強(qiáng)度，如圖3(a)所示，該材料在pH=4-9的環(huán)境中，均具有較強(qiáng)的熒光強(qiáng)度，可以滿足分析測試的要求，具有較好的適用范圍；此外，為探究Cu-MOF的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化，在濃度為0.01 mg mL-1，pH=7.0的情況下測定35 min，如圖3(b)所示，該材料在35 min內(nèi)的熒光強(qiáng)度基本保持不變，具有較好的穩(wěn)定性，可以滿足本實(shí)驗(yàn)的要求.

圖3 (a)pH對Cu-MOF的影響；(b)Cu-MOF的熒光隨時(shí)間的變化

2.2 不同濃度Cu-MOF檢測性能

如圖4所示，在測試體系中沒有四環(huán)素時(shí)，隨著Cu-MOF濃度的升高，其熒光強(qiáng)度也隨之增長，當(dāng)加入固定量四環(huán)素后，不同濃度的Cu-MOF熒光體系均出現(xiàn)熒光強(qiáng)度下降，且下降幅度基本一致，表明定量四環(huán)素對于Cu-MOF熒光的淬滅是穩(wěn)定的，不隨Cu-MOF濃度的變化而明顯改變，說明不同濃度Cu-MOF的檢測性能較為穩(wěn)定，有利于實(shí)際測試應(yīng)用.

圖4 不同濃度Cu-MOF檢測性能(測試體系四環(huán)素濃度為30 μM)

2.3 四環(huán)素檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線

在優(yōu)化的檢測條件下，對不同濃度的四環(huán)素進(jìn)行檢測.如圖5(a)所示，當(dāng)測試體系中沒有四環(huán)素時(shí)，Cu-MOF發(fā)射藍(lán)色熒光，發(fā)射光譜峰值在400 nm.隨著四環(huán)素的加入，Cu-MOF的熒光被逐漸淬滅，且出現(xiàn)紅移，在0-60 μM的范圍內(nèi)，在400 nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度持續(xù)降低.而當(dāng)四環(huán)素濃度大于60 μM后，Cu-MOF熒光強(qiáng)度降低變緩.Cu-MOF在400 nm處熒光強(qiáng)度與四環(huán)素濃度在0-60 μM范圍內(nèi)線性相關(guān)(圖5(b))，線性回歸方程為F=253.59-3.108C，R2=0.997，其中C是四環(huán)素的濃度.根據(jù)空白標(biāo)準(zhǔn)偏差的三倍計(jì)算出的TCs檢測的檢測限為33.33 nM，這個(gè)值遠(yuǎn)低于中國、美國和歐盟標(biāo)準(zhǔn).

圖5 (a) Cu-MOF熒光發(fā)射光譜隨四環(huán)素濃度增加的變化；(b) 四環(huán)素檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 Cu-MOF熒光淬滅機(jī)理

熒光淬滅的機(jī)理具有許多可能的途徑，例如靜態(tài)淬滅、動(dòng)態(tài)淬滅、共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)、聚集誘導(dǎo)淬滅效應(yīng)(ACQ)、光致電子轉(zhuǎn)移(PET)和內(nèi)濾波效應(yīng)(IFE)等.熒光的淬滅常可以由Stern-Volmer方程解釋描述

F0/F=1 +KSVcq=1 +Kqτ0cq，

(1)

其中F0和F分別為熒光測試體系中不存在四環(huán)素與存在四環(huán)素時(shí)的熒光強(qiáng)度，cq為測試體系中四環(huán)素的濃度，KSV是動(dòng)態(tài)淬滅常數(shù)，Kq是淬滅常數(shù)，而τ0是Cu-MOF的熒光壽命.如圖6(a)所示，線性檢測范圍的F0/F與cq呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，經(jīng)計(jì)算得KSV為0.03818 μM-1.圖6(b)得到τ0為4.278 ns，計(jì)算得Kq為8.925×1012M-1S-1，因此是靜態(tài)淬滅.圖6(b)顯示，Cu-MOF溶液加入四環(huán)素后，熒光壽命不變，也說明Cu-MOF的熒光淬滅的本質(zhì)為靜態(tài)淬滅.

圖6 (a)F0/F與四環(huán)素濃度的線性關(guān)系；(b)Cu-MOF熒光體系在有無四環(huán)素時(shí)熒光壽命

利用紫外可見吸收光譜，我們對Cu-MOF的淬滅機(jī)理進(jìn)行了進(jìn)一步的探究.如圖7(a)所示，四環(huán)素吸收光譜與Cu-MOF吸收和發(fā)射都有重疊，對應(yīng)熒光淬滅可能的機(jī)理為IFE和FRET，而加入四環(huán)素后Cu-MOF熒光壽命不變，所以我們認(rèn)為可以排除FRET淬滅機(jī)理，即IFE在Cu-MOF的淬滅中占主導(dǎo)作用.為了探究IFE在Cu-MOF的熒光淬滅過程中的作用，我們使用以下公式(2)對熒光進(jìn)行校正

Fcorr/Fobs=10(A(ex)+A(em))/2，

(2)

其中Fobs是測量得到的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)corr是從Fobs去除IFE影響后的熒光強(qiáng)度，A(ex)和A(em)分別為Cu-MOF溶液測試體系在激發(fā)波長(318 nm)和發(fā)射波長(402 nm)處的吸光度.對熒光強(qiáng)度進(jìn)行校正后，我們分別計(jì)算了校正前后的熒光抑制效率，如圖7(b)所示，在Cu-MOF熒光的淬滅中，IFE起到主要作用，因此Cu-MOF熒光淬滅機(jī)理的主要為IFE.

圖7 (a)四環(huán)素吸收光譜與發(fā)光Cu-MOF激發(fā)和發(fā)射光譜的重疊；(b)添加不同濃度TC后Cu-MOF的熒光抑制率，Eobs=1- Fobs/F0,obs，Ecorr=1-Fcorr/F0,corr，F(xiàn)和F0分別是存在和不存在TC時(shí)的熒光強(qiáng)度

2.5 選擇性考察

我們考察各種金屬離子(K+、Ca2+、Na+、Mg2+、Cu2+、Fe3+、Pb2+、Hg2+)、四環(huán)素類抗生素(金霉素、土霉素、強(qiáng)力霉素)以及其他類抗生素(青霉素G、鏈霉素、氨芐青霉素、頭孢噻肟鈉)對發(fā)光Cu-MOF熒光傳感體系的影響，Cu-MOF在400 nm處的熒光變化如圖8所示.加入四環(huán)素、土霉素、金霉素、強(qiáng)力霉素等四環(huán)素類抗生素后，Cu-MOF的熒光淬滅程度都較高，而其他干擾物的加入對Cu-MOF的熒光較小.值得一提的是，在眾多的依賴于對發(fā)光納米材料熒光的淬滅而構(gòu)建的分析方法中，Cu2+、Fe3+、Pb2+、Hg2+是非常常見的淬滅劑，而在本方法中，即便加入高濃度也未見明顯淬滅.由此可見，我們的方法有很好的選擇性.

圖8 選擇性考察(所有干擾物質(zhì)的濃度均為100 μM).A為未添加干擾物質(zhì)的正常測試體系，B～Q分別是：鹽酸四環(huán)素、土霉素、強(qiáng)力霉素、金霉素、NaCl2、MgSO4、KI、CaCl2、Cu(NO3)2、FeCl3、Pb(NO3)2、HgCl2、鏈霉素、青霉素、氨芐青霉素、頭孢噻肟鈉.

2.6 實(shí)際樣品檢測

為探索發(fā)光Cu-MOF體系在實(shí)際檢測中的應(yīng)用價(jià)值，我們將對四環(huán)素的檢測擴(kuò)展到河水樣品中.取寧波甬江水樣品，簡單離心除去不溶物，并將上清液用于四環(huán)素分析.至實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，未加標(biāo)準(zhǔn)樣品的甬江水樣品不會(huì)影響Cu-MOF熒光發(fā)射強(qiáng)度.隨后我們進(jìn)行了加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，如表1所示，三組獨(dú)立平行實(shí)驗(yàn)回收率分別為96.17%、105.02%和97.70%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為7.5%、5.4%和2.1%，均在合理的范圍內(nèi)，這證明我們的方法可以應(yīng)用于實(shí)際環(huán)境水樣品的檢測.

3 結(jié)論

本工作利用四環(huán)素類抗生素對發(fā)光Cu-MOF熒光的淬滅作用，構(gòu)建了一種四環(huán)素類抗生素含量的檢測方法，并成功應(yīng)用于環(huán)境水樣品中四環(huán)素類抗生素的分析.本方法具有3個(gè)特點(diǎn)：(1) 由于引入氨基和PVP，本工作合成的Cu-MOF在水溶液中的溶解性和穩(wěn)定性都更好；(2) 本方法的靈敏度高，其檢測限遠(yuǎn)低于國內(nèi)外規(guī)定的最大值，選擇性及穩(wěn)定性均較好，對常見的能夠淬滅熒光的金屬離子與四環(huán)素有較好的區(qū)分;(3) 此工作實(shí)現(xiàn)了發(fā)光Cu-MOF對環(huán)境水樣品中四環(huán)素的檢測，有望應(yīng)用于實(shí)際分析檢測中.